一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶的方法技术

本发明专利技术提供一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶的方法，具体检测方法如下：将带荧光标记的核酸链先用亚硫酸氢钠处理，核酸链上的胞嘧啶将全部变为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶则不受影响，再用化合物1可以特异性地与5-甲基胞嘧啶反应，而不与尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤反应；由于热哌啶可以将核酸中损伤后的碱基位置打断，故与化合物1反应后的核酸链用热哌啶处理后，通过聚丙烯酰胺变性胶的核酸条带可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶的位置和个数；化合物1的结构式为。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸化学领域，涉及核酸中5-甲基胞嘧啶的化学检测方法。
技术介绍
随着测序技术突飞猛进的发展和越来越多的基因序列及其功能被研究者们发现，人类迫切地想了解各种生命过程。基因支撑着生命的基本构造及功能，是遗传和变异的主要物质，包含生命的孕育、生长、衰老、凋亡等过程的全部信息。表观遗传学是遗传学的一个重要分支，研究的是非基因序列改变导致基因表达水平变化，如核酸甲基化和染色质构象变化等。人们慢慢认识到了表观遗传学的重要性。核酸甲基化被人们称为“基因沉默”的表观遗传学标志物。核酸甲基化与胚胎发育、转录、染色体结构、基因印记等有着非常密切的关系。近些年，研究者们越来越关注核酸甲基化。5-甲基胞嘧啶(5mC)也称为核酸的甲基化，其在生物体内的存在相对普遍。核酸甲基化是由核酸甲基转移酶催化作用，利用腺苷甲硫氨酸作为甲基给体，将甲基转移到胞嘧啶的5位上，从而形成5mC。研究者们随后发现TET家族酶可以将5mC转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC又会被进一步氧化为5-醛基胞嘧啶(5fC)，5fC继而会被氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)。5caC通过脱去羧基又变回到最初的胞嘧啶。现有的甲基化检测方法有液相质谱和质谱联用的方法，还有化学方法比如亚硫酸氢钠法，高碘酸钠法等，但是凡事都有不足之处，这些方法还有待完善来提高检测的精度。基于此我们专利技术了一种可以特异性的检测核酸中的5mC的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供了一种快速、有效和灵敏的检测5-甲基胞嘧啶的方法。本专利技术所提供的技术方案具体如下：一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶的方法，包括以下步骤：(1)将带荧光标记的核酸链用亚硫酸氢钠进行处理，将核酸上的胞嘧啶变为尿嘧啶；(2)加入化合物1进行处理，核酸链上5-甲基胞嘧啶与化合物1特异性结合，所述化合物1的结构式为(3)加入哌啶进行热处理，使与化合物1结合的5-甲基胞嘧啶的位置特异性地断裂；(4)将步骤(3)处理后的核酸链用冰乙醇沉淀旋干后上样至电泳槽，通过聚丙烯酰胺变性胶中的条带位置和个数确定5-甲基胞嘧啶的位置和个数。步骤(1)中将核酸链用亚硫酸氢钠进行处理的方式为：将核酸链与0.3M的NaOH溶液在42℃下反应0.5小时；再加入氢醌、NaHSO3，然后液体石蜡液封，50℃反应16小时。步骤(2)中将核酸链用化合物1进行处理的方式为：将亚硫酸氢钠处理后的核酸链加入到乙腈、pH＝5.0的Tris-HCl溶液、水和化合物1组成的混合溶液中，然后在50℃下反应10分钟。步骤(3)中加入哌啶热处理的方式为：化合物1处理后的核酸链用冰乙醇沉淀后旋干，再加入哌啶90℃处理0.5小时。所述的带荧光标记的核酸链为3’端用5-六氯荧光素氨基磷酸酯标记的DNA链。如图1所示，本专利技术是先将带荧光标记的核酸链用亚硫酸氢钠处理后，再用可以特异性和5mC反应的化合物1处理，再用哌啶处理，通过聚丙烯酰胺变性胶的核酸条带确定5mC的位置和个数。本专利技术是通过亚硫酸氢钠处理后，胞嘧啶则变为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶不受影响，由于化合物1可以特异性地和5-甲基胞嘧啶反应而不和尿嘧啶反应，经过亚硫酸氢钠处理后的核酸链的5mC的位置将会被化合物1损伤，其他碱基不受影响。损伤的位置经过哌啶的热处理会使核酸中5mC的位置特异性的断裂，从而会在20％的核酸聚丙烯酰胺变性胶上看到特异性的核酸断裂带，从而确定核酸中5mC在核酸序列中的位置和个数。附图说明图1为本专利技术检测核酸中5-甲基胞嘧啶的方法的流程示意图。图2为本专利技术的反应原理示意图。图3为含有1个5-甲基胞嘧啶本专利技术方法处理后的变性胶图；其中，条带1代表A+G序列；条带2代表G序列；条带3代表本专利技术方法处理后的变性胶图。图4为含有2个5-甲基胞嘧啶本专利技术方法处理后的变性胶图；其中，条带1代表A+G序列；条带2代表G序列；条带3代表本专利技术方法处理后的变性胶图。具体实施方式以下以具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明。以下实施例中用于标记核酸的荧光物质为HEX，中文名为5-六氯荧光素氨基磷酸酯，所用核酸链为市售DNA链，所用化合物1的结构式为实施例1:含5-甲基胞嘧啶的核酸链的亚硫酸氢钠处理移取3’端用荧光物质HEX(中文名为5-六氯荧光素氨基磷酸酯)标记的含5-甲基胞嘧啶的DNA(10μM)2μL加入48μL的水，再加入5.5μL新配制的NaOH溶液(3M)，42℃水浴孵育0.5小时，水浴孵育完成后加入30μL的氢醌(10mM)，再加入520μLNaHSO3溶液(3.6M,pH＝5.0)以及200μL石蜡油液封，50℃避光水浴孵育16小时，将DNA上的胞嘧啶变为尿嘧啶。反应结束后用除盐柱除盐，提纯DNA。实施例2：亚硫酸氢钠处理后的DNA用化合物1和体积分数为10％哌啶处理取亚硫酸氢钠处理后的含5-甲基胞嘧啶的DNA(10μM)4μL，加入10μL的乙腈、2μL的Tris-HCl溶液(1M,pH＝5.0)、2μL的水和2μL的化合物1(20mM)，50℃热处理10分钟，DNA链上5-甲基胞嘧啶与化合物1特异性结合；然后冰乙醇沉淀，离心，旋干溶剂，再加入体积分数为10％的哌啶90℃反应0.5h，使与化合物1结合的5-甲基胞嘧啶的位置特异性地断裂；然后冰乙醇沉淀，离心，旋干溶剂。上样至电泳槽，2小时后观察照胶结果，通过与A+G序列的对照和G序列的对照比较，可以明显通过聚丙烯酰胺变性胶中DNA条带对应的位置和个数确定5-甲基胞嘧啶的位置和个数。上述实施例为本专利技术较佳的实施方式，但本专利技术的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测核酸中5‑甲基胞嘧啶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将带荧光标记的核酸链用亚硫酸氢钠进行处理，将核酸上的胞嘧啶变为尿嘧啶；(2)加入化合物1进行处理，核酸链上5‑甲基胞嘧啶与化合物1特异性结合，所述化合物1的结构式为(3)加入哌啶进行热处理，使与化合物1结合的5‑甲基胞嘧啶的位置特异性地断裂；(4)将步骤(3)处理后的核酸链用冰乙醇沉淀旋干后上样至电泳槽，通过聚丙烯酰胺变性胶中的条带位置和个数确定5‑甲基胞嘧啶的位置和个数。

【技术特征摘要】
1.一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将带荧光标记的核酸链用亚硫酸氢钠进行处理，将核酸上的胞嘧啶变为尿嘧啶；
(2)加入化合物1进行处理，核酸链上5-甲基胞嘧啶与化合物1特异性结合，所述化
合物1的结构式为(3)加入哌啶进行热处理，使与化合物1结合的5-甲基胞嘧啶的位置特异性地断裂；
(4)将步骤(3)处理后的核酸链用冰乙醇沉淀旋干后上样至电泳槽，通过聚丙烯酰胺
变性胶中的条带位置和个数确定5-甲基胞嘧啶的位置和个数。
2.根据权利要求1所述的检测核酸中5-甲基胞嘧啶的方法，其特征在于：步骤(1)中
将核酸链用亚硫酸氢钠进行处理的方式为：将核酸链与0.3M的NaOH溶液在42℃下反应0.5
小时；再加入氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，王雅芬，毛伍祥，刘朝兴，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42