一种敲除TNK1基因的细胞系及其构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种敲除TNK1基因的细胞系及其制备方法及其应用，所述敲除TNK1基因的细胞系其包含人前列腺癌转基因细胞PC‑3/TNK1‑2C16和/或6或人前列腺癌转基因细胞PC‑3/TNK1‑3C1，所述人前列腺癌转基因细胞PC‑3/TNK1‑2C16的微生物保藏号是CCTCC NO：C2017189，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。采用本发明专利技术的技术方案，无需对pX330质粒进行改造，而是将质粒pX330/sgRNA与pEGFP‑N1按一定比例共转细胞，从而达到检测TNK1 sgRNA的敲除效率及建立稳定细胞系的目的；该方法简单、易行。

A cell line that knocks the TNK1 gene and its construction method and its application

The present invention provides a method and application of TNK1 gene knockout cell lines and its preparation, the TNK1 gene knockout cell lines containing human prostate cancer cells PC 3/TNK1 2C16 transgenic and / or 6 human prostate cancer cells or transgenic PC 3/TNK1 3C1, the prostate microbial preservation No. cancer cell PC 3/TNK1 2C16 transgenic is CCTCC NO:C2017189, the collection date is September 18, 2017, the preservation unit culture collection center as a typical China. The technical scheme of the invention, without modifying the pX330 plasmid, but the plasmids of pX330/sgRNA and pEGFP N1 according to certain proportion were transferred to the cells, so as to achieve the detection of TNK1 sgRNA knockdown efficiency and establish a stable cell line; this method is simple and easy.

【技术实现步骤摘要】
一种敲除TNK1基因的细胞系及其构建方法及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种敲除TNK1基因的细胞系及其制备方法及其应用。
技术介绍
CRISPR-Cas是一种细菌及古细菌的获得性免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵。CRISPR的全称为clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(成簇规律间隔短回文重复序列)，是细菌基因组上的特殊序列。Cas蛋白有若干种，具有内切核酸酶活性。当细菌遭受噬菌体、病毒或者外源质粒首次入侵时，Cas蛋白对入侵的DNA进行剪切，剪切后的DNA片段被整合到CRISPR位点的重复序列之间，成为间隔序列，使细菌产生相应的“记忆”。当外源遗传物质再次入侵时，CRISPR的转录产物crRNA(含间隔序列)可将Cas蛋白靶向到外源DNA，并将它们切断，从而沉默外源基因的表达。CRISPR-Cas系统拥有三种类别，其中CRISPR-Cas9是目前研究最深入、应用最成熟的一种类别。2015年底，《科学》杂志将CRISPR-Cas9技术列为“年度十大科学发现”之首。这项被誉为“上帝的剪刀”的技术让人们本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除TNK1基因的PC3细胞系，其特征在于：其包含人前列腺癌转基因细胞PC‑3/TNK1‑2C16和/或人前列腺癌转基因细胞PC‑3/TNK1‑3C1，所述人前列腺癌转基因细胞PC‑3/TNK1‑2C16的微生物保藏编号是CCTCC NO：C2017189，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；所述人前列腺癌转基因细胞PC‑3/TNK1‑3C1的微生物保藏编号是CCTCC NO：C2017180，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

【技术特征摘要】
1.一种敲除TNK1基因的PC3细胞系，其特征在于：其包含人前列腺癌转基因细胞PC-3/TNK1-2C16和/或人前列腺癌转基因细胞PC-3/TNK1-3C1，所述人前列腺癌转基因细胞PC-3/TNK1-2C16的微生物保藏编号是CCTCCNO：C2017189，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；所述人前列腺癌转基因细胞PC-3/TNK1-3C1的微生物保藏编号是CCTCCNO：C2017180，保藏日期为2017年9月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。2.一种敲除TNK1基因的PC3细胞系的建立方法，其特征在于：其包括以下步骤：步骤S1，TNK1sgRNA序列的设计及评估；步骤S2，构建pX330/TNK1sgRNA质粒；步骤S3，在PC-3细胞中按15：1的比例共转pX330/TNK1sgRNA质粒及含真核细胞抗药性基因载体pEGFP-N1，筛选G418抗性细胞群；步骤S4，筛选能有效降低TNK1表达的TNK1sgRNA序列；步骤S5，筛选具G418抗性的细胞克隆；步骤S6，筛选TNK1表达敲除的细胞克隆。3.根据权利要求2所述的敲除TNK1基因的PC3细胞系的建立方法，其特征在于：步骤S1中，所述TNK1sgRNA为TNK1sgRNA1、TNK1sgRNA2或TNK1sgRNA3，所述TNK1sgRNA1的序列如SEQIDNO：1所示，所述TNK1sgRNA2的序列如SEQIDNO：2所示，所述TNK1sgRNA3的序列如SEQIDNO：3所示。4.根据权利要求3所述的敲除TNK1基因的PC3细胞系的建立方法，其特征在于：步骤S2中构建pX330/TNK1sgRNA质粒包括以下子步骤：子步骤S201，根据TNK1sgRNA1、TNK1sgRNA2或TNK1sgRNA3的序列，合成三对互补的单链DNA寡聚体；子步骤S202，将合成的单链DNA寡聚体转变成双链DNA寡聚体，反应条件为：37℃，30min；95℃，5min；以5℃/min的速度将温度降至25℃；子步骤S203，将双链DNA寡聚体与经BbsI...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕斌，孙招金，
申请(专利权)人：深圳生生凡非基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44