抗菌功能增强型间充质干细胞及其在脓毒症中的应用制造技术

本发明专利技术属于干细胞治疗技术领域，主要涉及一种抗菌融合蛋白修饰的间充质干细胞的构建及其在脓毒症中的应用。针对间充质干细胞自身分泌抗菌肽LL‑37功能不强，难以达到良好的抗菌、抗内毒素和抗炎效果的问题，本发明专利技术构建了重组载体，将人LL‑37抗菌肽基因与人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因rBPI21串联并克隆入病毒载体，病毒感染并修饰间充质干细胞，使间充质干细胞在拥有组织再生修复能力的同时，又能高效分泌表达广谱抗菌融合蛋白而获高效广谱抗菌能力。本发明专利技术有效的将干细胞治疗和基因治疗相结合起来，为脓毒症的治疗提供了一个新的选择。

Antibacterial function enhanced mesenchymal stem cells and their application in sepsis

The invention belongs to the field of stem cell therapy, mainly relates to the construction of an antibacterial fusion protein modified mesenchymal stem cell and its application in sepsis. The mesenchymal stem cells secreted antimicrobial peptide LL 37 function is not strong, it is difficult to achieve good antibacterial and anti-inflammatory, anti endotoxin effect, the invention constructs a recombinant vector, the LL 37 antimicrobial peptide gene and active fragment of human bactericidal / permeability increasing protein rBPI21 gene was cloned into the vector series, virus infection and modification of mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cells in tissue regeneration and repair ability, and secretory expression of fusion protein and a broad-spectrum antibacterial broad-spectrum antibacterial ability. The invention effectively combines stem cell therapy with gene therapy to provide a new choice for the treatment of sepsis.

【技术实现步骤摘要】
抗菌功能增强型间充质干细胞及其在脓毒症中的应用
本专利技术属于干细胞治疗
，主要涉及一种抗菌融合蛋白修饰的间充质干细胞的构建及其在脓毒症中的应用。
技术介绍
脓毒症是机体对感染的免疫反应失调而导致危及生命的器官功能障碍的综合征，进一步发展可导致休克、急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症、急性肾损伤、弥漫性血管内凝血等并发症，具有病情恶化快及死亡率高的特点，是严重感染、严重烧创伤患者后期死亡的主要原因。它主要表现为机体在感染或者创伤等应激状态下，机体的免疫系统被过度激活，炎症细胞因子如IL-1、TNF-ɑ和IL-6等迅速大量产生，引起脓毒性休克和多器官功能衰竭，甚至死亡。近年来，虽然针对脓毒症的抗感染治疗已取得了巨大进步，但遗憾的是，脓毒症的发病率和病死率仍居高不下。临床上，抗生素是治疗脓毒症最常用的药物。但是，对抗生素敏感的脓毒症患者应用大量抗生素后，在杀灭病原菌的同时，大量死亡的病原体可释放超量的毒素和细菌DNA，这些致病分子可进一步激发机体过度炎症反应，加速多器官功能障碍而死亡。大量抗生素的使用,会导致耐药菌株增多,且产生多重耐药的现象,可能会出现无药可控的病原菌感染患者。在抗感染、抗炎、调节凝血系统和器官功能障碍等方面，机体有复杂和多样的应激反应，使得单一针对脓毒症发病机制中某一关键介质或者调控环节的治疗措施不能获得令人满意的临床治疗效果。H1A1(LPS抗体)、rBPI21(抗感染、抗炎)和APC(抗凝剂)等针对单一介质或者调控环节而设计的众多临床药物试验均以失败而告终。由此提示我们，“菌、毒、炎和组织修复综合并治”的综合治疗策略可能才是脓毒症治疗的理想策略。干细胞治疗已成为治疗许多疾病的重要手段。间充质干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能干细胞，不仅直接通过分化参与组织修复，同时还可以通过旁分泌产生的细胞因子和生长因子间接参与，促进受损组织的再生修复与功能恢复。在临床上，干细胞应用于股骨头坏死缺损、急性肺损伤、急性肾损伤等疾病的治疗，并取得了非常好的疗效。此外，MSCs还具有极强的抗炎和免疫调节功能以及有限抗菌能力，其主要机制为:①MSCs自身可分泌一些可溶性杀菌物质，如分泌的抗菌肽LL-37直接清除病原菌；②MSCs还可通过旁分泌功能，一方面分泌TSG-6、IL-10、PGE2、IL-4等抗炎因子，调节机体的炎症反应；③MSCs通过与巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞等细胞相互作用，促进免疫细胞表达IL-10、IL-4等抗炎因子，抑制TNF-ɑ、IL-6等促炎因子的释放。MSCs具有免疫调节、组织再生修复、低免疫原性和取材方便等特点，可发挥对脓毒症综合治疗和保护作用，因此被认为在脓毒症治疗方面具有巨大潜力。然而，较脓毒症爆发后所具有的菌量和毒素而言，MSCs自身分泌的抗菌蛋白的抗菌和内毒素中和能力非常有限。因此，对MSCs进行一些处理或者修饰，赋予其更强的抗菌、抗内毒素和抗炎作用，将更有助于提高MSCs在脓毒症治疗中的价值。抗菌肽(AMPs)是机体固有免疫系统抗感染的重要成分，不仅具有对细菌、真菌等病原体有着广泛、高效的杀灭作用，而且还具有中和内毒素作用及不易产生耐药性等特点。研究发现，人类自身细胞能够分泌多种抗菌蛋白，其中杀菌/通透性增加蛋白(BPI)具有抗革兰阴性细胞、抗真菌、免疫调节和内毒素中和的能力。以BPI为模板，研发出具有更好抗菌活性和内毒素中和活性的rBPI21，它可以明显改善多种临床感染和内毒素血症，显著降低死亡率。但rBPI21的分子量较小，很容易被肾脏代谢出去，在机体内存在的半衰期短，加上对革兰氏阳性菌没有杀伤作用，致III期临床失败。因此，提高BPI半衰期和抗菌谱或者在体内持续存在成为推动其在临床应用的一个研究方向。抗菌肽LL37是人体表达的唯一一种Cathelicidin蛋白，其C′端以两个亮氨酸开始的37个氨基酸，它在人的多种组织和细胞中分泌表达，具有广谱抗菌活性。研究发现，抗菌肽LL-37不仅具有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、抗真菌及抗病毒等功能，还具有免疫调节以及中和内毒素等作用。LL37拥有广谱高效的抗病原菌功能，具有广泛应用于临床的巨大潜力。细胞治疗联合基因治疗是一种增强治疗效果的策略。基因修饰的间充质干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞等均显示了对多种疾病具有良好的治疗效果。因此，是否可以通过生物技术构建rBPI21/LL37融合蛋白修饰的间充质干细胞，用于更高效的治疗脓毒症，是现阶段本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
针对上述间充质干细胞自身分泌抗菌肽LL-37功能不强，难以达到良好的抗菌、抗内毒素和抗炎效果的问题，本专利技术通过构建重组载体的方式，将人LL-37抗菌肽基因与人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因(rBPI21)串联并克隆入病毒载体，病毒感染并修饰间充质干细胞，使间充质干细胞在拥有组织再生修复能力的同时，又能高效分泌表达广谱抗菌融合蛋白而获高效广谱抗菌能力。本专利技术要解决的第一个技术问题为：提供一种表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的间充质干细胞含有的重组载体中含有能编码抗菌融合蛋白rBPI21-LL37和/或抗菌融合蛋白LL37-BPI21的编码基因，能够表达抗菌融合蛋白rBPI21-LL37和/或抗菌融合蛋白LL37-BPI21。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的抗菌融合蛋白rBPI21-LL37的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、rBPI21蛋白信号肽的编码序列、编码rBPI21蛋白的基因、连接肽的基因、抗菌肽LL-37的基因。进一步的，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的抗菌融合蛋白LL37-BPI21的表达框架为：从5’到3’方向依次为启动子、抗菌肽LL-37信号肽的编码序列、编码抗菌肽LL-37的基因、连接肽的基因、rBPI21蛋白的基因。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的启动子为常启动子。进一步的，所述的常启动子为CMV启动子。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的rBPI21蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。优选的，所述的rBPI21蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的抗菌肽LL-37的氨基酸序列为SEQIDNO：3所示。优选的，所述的抗菌肽LL-37的编码核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的连接肽的氨基酸序列为SEQIDNO：5所示。优选的，所述连接肽的编码核苷酸序列为SEQIDNO：6所示。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的人源rBPI21蛋白信号肽的氨基酸序列为SEQIDNO：7所示。优选的，所述人源rBPI21蛋白信号肽的编码核苷酸序列为SEQIDNO：8所示。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述的抗菌肽LL-37信号肽的的氨基酸序列为SEQIDNO：9所示。优选的，所述LL37信号肽的编码核苷酸序列为SEQIDNO：10所示。其中，上述表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，所述重组载体为病毒载体。优选的，所述病毒载体为慢病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞含有的重组载体中含有能编码抗菌融合蛋白rBPI21‑LL37和/或抗菌融合蛋白LL37‑BPI21的编码基因，能够表达抗菌融合蛋白rBPI21‑LL37和/或抗菌融合蛋白LL37‑BPI21。

【技术特征摘要】
1.表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞含有的重组载体中含有能编码抗菌融合蛋白rBPI21-LL37和/或抗菌融合蛋白LL37-BPI21的编码基因，能够表达抗菌融合蛋白rBPI21-LL37和/或抗菌融合蛋白LL37-BPI21。2.根据权利要求1所述的表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，其特征在于：所述的抗菌融合蛋白rBPI21-LL37的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、rBPI21蛋白信号肽的编码序列、编码rBPI21蛋白的基因、连接肽的基因、抗菌肽LL-37的基因。3.根据权利要求1所述的表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，其特征在于：所述的抗菌融合蛋白LL37-BPI21的表达框架为：从5’到3’方向依次为启动子、抗菌肽LL-37信号肽的编码序列、编码抗菌肽LL-37的基因、连接肽的基因、rBPI21蛋白的基因。4.根据权利要求1所述的表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，其特征在于：所述的启动子为常启动子；进一步的，所述的常启动子为CMV启动子。5.根据权利要求1所述的表达抗菌融合蛋白重组载体修饰的间充质干细胞，其特征在于，满足下述至少一项：所述的rBPI2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐祥，李战，宋昱庆，袁培淞，
申请(专利权)人：重庆赛托斯创生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50