一种多联管式脂肪干细胞提取方法技术

本发明专利技术公开了一种多联管式脂肪干细胞提取方法，包括清洗、剪碎、消化、再消化、再消化后清洗、过滤、培养、换液、传代等步骤。在上述步骤中，采用多联管式的操作方法，有效清除脂肪组织中的血细胞、油滴及其他杂质，保证提取的脂肪干细胞的纯度；剪碎步骤，能够最大限度的促进后续脂肪组织与消化酶的接触面，缩短消化时间，避免消化酶对细胞的损伤；再消化步骤增加脂肪干细胞的获得率；换液步骤减少油滴对细胞贴壁的影响同时促进更多细胞贴壁。本发明专利技术的脂肪干细胞提取方法简单易用，能够极大的降低红细胞和油滴等对脂肪干细胞的影响，同时最大程度的利用脂肪组织获得脂肪干细胞，脂肪干细胞获得率明显提高。

A method of extraction of adipose stem cells by multi tube method

【技术实现步骤摘要】
一种多联管式脂肪干细胞提取方法
本专利技术涉及干细胞提取领域，具体涉及一种多联管式脂肪干细胞提取方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)来源于中胚层，是一种类似成纤维细胞样形态，贴壁生长，表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19的细胞；它可以从骨髓、脂肪、脐带华通氏胶、胎盘、脐带血、牙髓、绒毛膜等多种组织中被分离出来；它是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，能体外培养并在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSCs在细胞治疗中有广泛的用途，包括组织工程、再生医学和被用作基因治疗的载体。脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是一种从脂肪组织中分离出来的间充质干细胞，具有多向分化潜能，能够在体外进行大规模培养，可向脂肪、骨、软骨、内皮等多种方向进行分化，且取材方便、创口小、不存在异体排斥性等特点，是一种理想的种子干细胞。脂肪干细胞能够分化成血管内皮细胞，促进血管生成和提高移植物存活率；可释放对抗缺氧和其他不利条件的血管内皮生长因子进而影响周围宿主组织；脂肪干细胞能够进行稳定增殖，维持一定的数量，因此脂肪干细胞移植在医学美容以及临床治疗上具有重要的应用价值。脂肪干细胞作为理想的干细胞来源排除了其他干细胞对于年龄和性别的限制，大大提高了获得和利用自体干细胞的条件。目前脂肪干细胞的分离提取方法主要有组织块贴壁法和普通酶解法，但两种方法均存在一定的缺陷，组织块贴壁法细胞迁出时间久并且贴壁困难，普通酶解法细胞得率和纯度不高。此外，以上两种方法还存在以下问题：脂肪组织中的油滴阻碍脂肪细胞的贴壁以及红细胞占据培养瓶底贴壁空间，而这些问题都会极大的影响脂肪干细胞的得率和纯度。
技术实现思路
本专利技术旨在解决目前脂肪干细胞提取过程中存在的问题，提供一种多联管式脂肪干细胞提取方法，可以有效的去除脂肪干细胞中的油滴、清除脂肪组织中多余的杂质、提高脂肪干细胞的得率和纯度，很好的解决了脂肪干细胞迁出困难以及不易贴壁等问题。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种多联管式脂肪干细胞提取方法，包括以下步骤：(1)清洗：(1a)将无菌获取的脂肪组织加入离心管中，用等体积的生理盐水重悬脂肪组织，以转速400～600rpm离心4-8min；(1b)使用移液管将脂肪组织层挑取到另一空离心管中，加入等体积的生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心4-8min；(2)剪碎：将所述步骤(1b)清洗之后的脂肪组织挑入另一空的离心管中，剪切约5～10min，使之成为组织块匀浆，再重复上述步骤(1b)直至生理盐水呈透明；(3)消化：将上述清洗后的脂肪组织匀浆挑入空离心管中，并加入等体积的胶原酶，置于35-40℃水浴中、以转速100～200rpm震荡消化20～50min，然后加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～8min；(4)再消化：将上述步骤(3)消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到空离心管中，加入等体积的胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液；(5)再消化后清洗：收集上述步骤(3)和(4)底部所得的所有脂肪组织及细胞匀浆，并向收集的脂肪组织及细胞匀浆中加入2～3倍体积的生理盐水重悬，以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液；(6)过滤：将步骤(4)再清洗后的脂肪组织及细胞匀浆，用100μm过滤器过滤，再将过滤得到的下层滤液以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上层溶液；(7)培养：在步骤(5)过滤后的脂肪组织及细胞匀浆中，加入间充质干细胞无血清完全培养基重悬，并将其转移至细胞培养瓶，置于细胞培养箱中培养；(8)换液：在步骤(6)培养3h-24h后，收集细胞培养瓶中的上清进行离心，加入间充质干细胞无血清完全培养基重悬后，加入到原来的培养瓶中继续培养；(9)传代：每隔3天更换培养基，待细胞融合度达到80％时，用生理盐水清洗2次后，加入胰酶消化4-8min，再加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收获脂肪干细胞。在本专利技术的一种优选方案中，在所述步骤(9)之后增加再植步骤，所述再植步骤为：将步骤(9)中消化后的培养瓶用PBS清洗2遍，向未消化完全的脂肪干细胞中加入间充质干细胞无血清完全培养基，继续培养，并重复步骤(9)，收获脂肪干细胞。在本专利技术的一种优选方案中，所述步骤(1a)中加入离心管的脂肪组织为20ml；所述步骤(7)和步骤(8)中的间充质干细胞无血清完全培养基的加入量均为15ml；所述步骤(9)中胰酶Trypsin的加入量为3ml，终止消化的生理盐水或培养基的加入量为5-10ml。在本专利技术的一种优选方案中，所述步骤(3)和(4)中的胶原酶为I型胶原酶，所述步骤(9)中的胰酶为胰酶Trypsin。在本专利技术的一种优选方案中，所述生理盐水含有三抗。由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果为：1、本专利技术通过多个离心管之间脂肪组织的挑取，即通过多联管式挑取脂肪组织进入另外的离心管，可有效清除脂肪组织中的血细胞、油滴及其他杂质，保证提取的脂肪干细胞的纯度。2、将首次消化后的脂肪组织离心得到脂肪细胞，同时将上清液中未完全消化的脂肪组织收集进行二次消化，增加了脂肪干细胞的获得率。3、细胞贴壁后通过培养瓶换液，可以减少油滴对细胞贴壁的影响同时促进更多细胞贴壁：待细胞贴壁后收集上清离心，能够去除脂肪组织中的残留的油滴；将新鲜培养基重悬继续加入培养瓶中培养能够促进更多脂肪干细胞贴壁及提高增长速率。4、本专利技术中，在消化步骤之前，并且在初步清洗之后，通过剪碎脂肪组织成为脂肪组织块匀浆，能够最大限度的促进后续脂肪组织与消化酶的接触面，缩短消化时间，避免消化酶对细胞的损伤。5、此外，本专利技术用胰酶Trypsin消化贴壁的脂肪干细胞，设定5min终止，对于贴壁牢固的脂肪细胞，通过再植步骤将5min仍未从培养瓶壁上脱离下来的脂肪细胞清洗后继续培养，可以降低胰酶对细胞的伤害并增加脂肪干细胞的获得率。本专利技术多联管式脂肪干细胞提取方法简单易用，通过上述步骤方法，能够极大的降低红细胞和油滴等对脂肪干细胞的影响，同时最大程度的利用脂肪组织获得脂肪干细胞，本专利技术方法提取的脂肪干细胞获得率明显提高。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例1换液步骤后培养瓶中的脂肪干细胞图片。图2为本专利技术实施例2换液步骤后培养瓶中的脂肪干细胞图片。图3为本专利技术实施例3再植步骤后培养瓶中的脂肪干细胞图片。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多联管式脂肪干细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)清洗：(1a)将无菌获取的脂肪组织加入离心管中，用等体积的生理盐水重悬脂肪组织，以转速400～600rpm离心4-8min；(1b)使用移液管将脂肪组织层挑取到另一空离心管中，加入等体积的生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心4-8min；/n(2)剪碎：将所述步骤(1b)清洗之后的脂肪组织挑入另一空的离心管中，剪切约5～10min，使之成为组织块匀浆，再重复上述步骤(1b)直至生理盐水呈透明；/n(3)消化：将上述清洗后的脂肪组织匀浆挑入空离心管中，并加入等体积的胶原酶，置于35-40℃水浴中、以转速100～200rpm震荡消化20～50min，然后加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～8min；/n(4)再消化：将上述步骤(3)消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到空离心管中，加入等体积的胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液；/n(5)再消化后清洗：收集上述步骤(3)和(4)底部所得的所有脂肪组织及细胞匀浆，并向收集的脂肪组织及细胞匀浆中加入2～3倍体积的生理盐水重悬，以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液；/n(6)过滤：将步骤(4)再清洗后的脂肪组织及细胞匀浆，用100μm过滤器过滤，再将过滤得到的下层滤液以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上层溶液；/n(7)培养：在步骤(5)过滤后的脂肪组织及细胞匀浆中，加入间充质干细胞无血清完全培养基重悬，并将其转移至细胞培养瓶，置于细胞培养箱中培养；/n(8)换液：在步骤(6)培养3h-24h后，收集细胞培养瓶中的上清进行离心，加入间充质干细胞无血清完全培养基重悬后，加入到原来的培养瓶中继续培养；/n(9)传代：每隔3天更换培养基，待细胞融合度达到80％时，用生理盐水清洗2次后，加入胰酶消化4-8min，再加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收获脂肪干细胞。/n...

【技术特征摘要】
1.一种多联管式脂肪干细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)清洗：(1a)将无菌获取的脂肪组织加入离心管中，用等体积的生理盐水重悬脂肪组织，以转速400～600rpm离心4-8min；(1b)使用移液管将脂肪组织层挑取到另一空离心管中，加入等体积的生理盐水，震荡混匀后，以转速500～600rpm离心4-8min；
(2)剪碎：将所述步骤(1b)清洗之后的脂肪组织挑入另一空的离心管中，剪切约5～10min，使之成为组织块匀浆，再重复上述步骤(1b)直至生理盐水呈透明；
(3)消化：将上述清洗后的脂肪组织匀浆挑入空离心管中，并加入等体积的胶原酶，置于35-40℃水浴中、以转速100～200rpm震荡消化20～50min，然后加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～8min；
(4)再消化：将上述步骤(3)消化得到的上层溶液及组织，吸除上层油滴层后，将未完全消化组织收集到空离心管中，加入等体积的胶原酶，消化15～30min，然后通过加入生理盐水或间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，再以转速1300～1800rpm离心5～6min，弃上层溶液；
(5)再消化后清洗：收集上述步骤(3)和(4)底部所得的所有脂肪组织及细胞匀浆，并向收集的脂肪组织及细胞匀浆中加入2～3倍体积的生理盐水重悬，以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上清溶液；
(6)过滤：将步骤(4)再清洗后的脂肪组织及细胞匀浆，用100μm过滤器过滤，再将过滤得到的下层滤液以转速1000～1300rpm离心5～8min，弃上层...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟强，邵文陶，邹桥，
申请(专利权)人：重庆赛托斯创生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50