一种改良型间充质干细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞的制备方法及其应用。所公开的方法包括：采用添加有卵泡抑素样蛋白1的培养基培养间充质干细胞。本发明专利技术所述的本发明专利技术制备方法所得的MSCs细胞产品可应用于包括肝和其他器官炎症及纤维化的治疗。同时通过本发明专利技术的制备方法可促进MSCs在体内向受损脏器的定向迁移，提高MSCs“归巢”效率及免疫调节能力。

Preparation and application of an improved mesenchymal stem cell

【技术实现步骤摘要】
一种改良型间充质干细胞的制备方法及应用
本发属于生物制药
，涉及一种间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)的制备方法及其应用。
技术介绍
MSCs是一类中胚层来源的非造血成体干细胞，其具有较强的自我更新能力，能够分化为中胚层来源的软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞及多种外胚层和内胚层来源细胞。MSCs存在于几乎所有组织中，能够从骨髓、脂肪组织、肝脏、肌肉、肺等器官中组织中分离并进行体外扩增。不同组织来源的MSCs普遍具有类似的生物学特性：贴壁生长，表达CD73、CD90、CD105特异性表面标志物，普遍不表达CD14、CD34、CD45等造血相关表面标志物(除脂肪来源的MSCs表达CD34)，可在体外诱导为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。在自然状态下，MSCs是一类MHCI+、MHCII-、CD40-、CD80-、CD86-低免疫原性的细胞，通过旁分泌细胞因子或细胞间相互作用MSCs对T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等多种细胞类型发挥免疫调节作用。利用MSCs治疗的临床实验最早开始于2004年，目前在全球范围内已注册的MSCs临床实验有800多项(May2019,clinicaltrials.gov)。随着临床实验的进行，MSCs治疗的有效性已经在多种疾病(肝、脑、肺、脊髓等多种组织损伤)中得到证实。尽管目前普遍认为MSCs在多种疾病治疗中具有一定的疗效，但距离临床推广应用还有亟待解决的问题，如MSCs向损伤组织的迁移率低。MSCs在受损部位的低迁移率和定植率对于其疗效的发挥可能有直接的影响。研究人员通过动物活体示踪技术观察MSCs在体的分布情况，结果发现MSCs在体内可散在分布于肝、肺、脾脏等多个器官，只有部分细胞可定向迁移至受损部位。在多项肝损伤治疗模型中已经证实，MSCs归巢率降低在很大程度上影响了其治疗效果。因此，如何提高MSCs在机体内向受损部位的定向迁移能力，减少在其他“无效”脏器的分布，是提高MSCs疗效亟待解决的问题。
技术实现思路
卵泡抑素样蛋白1(Follistatin-like1，FSTL1)是TGF-β1诱导的细胞外分泌糖蛋白；在纤维化进展过程中，FSTL1可通过促进肌成纤维细胞表面TGF-β配体-受体结合促进下游Smad信号活化，促纤维化基因表达。并且在培养基中添加FSTL1重组蛋白，可以起到活化TGF-β信号、促进下游靶基因表达的作用。专利技术人研究过程中却意外发现培养过程中添加FSTL1的间充质干细胞在治疗CCl4诱导的小鼠肝纤维化的治疗模型时，可极大改善MSCs的肝纤维化治疗效果。专利技术人进一步研究发现经本专利技术改良后的间充质干细胞高表达CXCR4，细胞获得较强的迁移能力；炎症因子IL-6，IL-1β、TNF-α的表达降低超过30％，共培养的炎症细胞的比例降低。因此，在疾病进展期注入改良后的MSCs，细胞向受损脏器的定向迁移、免疫调节能力增强，有利于进一步改善MSCs的疾病治疗效果。基于上述发现，本专利技术提供了一种改良型间充质干细胞的制备方法，方法包括：采用添加有卵泡抑素样蛋白1的培养基培养间充质干细胞。可选的，所述间充质干细胞不仅仅限于人原代脐带间充质干细胞，此处的动物为大鼠，小鼠，豚鼠，驯养动物为兔子，猫，狗，牛，羊，猪，马，灵长类动物为猴子和人。更进一步，所述间充质干细胞不仅仅限于脐带来源，还可以为骨髓、脂肪组织、滑膜组织、肺组织、脐带血或外周血来源的间充质干细胞。可选的，卵泡抑素样蛋白1不仅仅限于人源蛋白，还可来源于：小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，猫，狗，牛，羊，猪，马等驯养动物或如猴子等灵长类动物，。本专利技术方法改良的MSCs用于肝纤维化的优化治疗，细胞产品可应用于制备治疗炎症疾病及纤维化疾病的药物。在不改变MSCs鉴定相关的细胞表面标志物的基础上，本专利技术制备方法可促进MSCs在体内向受损脏器的定向迁移，将使得MSCs治疗更具有靶向性和免疫调节性，显著提高MSC的治疗效果。附图说明图1通过流式细胞仪检测改良后的MSCs细胞表面标志物CD105，CD90和CD34的表达情况；MSCs(F)表示本专利技术的MSCs；图2通过实时定量PCR(A)、Westernblot(B)检测FSTL1的加入对MSCs内源性FSTL1表达的影响；图3在培养过程加入FSTL1的MSCs治疗CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型；A图为病理染色，B图为纤维化面积统计分析，C图为肝功能指标；图4肝纤维化小鼠模型中在培养过程加入FSTL1的MSCs对巨噬细胞表型转化的影响；A图为标记M1型巨噬细胞(iNOS)，B图为标记M2型巨噬细胞(CD206)；图5在培养过程加入FSTL1的MSCs在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型各器官中的分布(两小时(2h)、第一天(D1)、第三天(D3)第7天(D7))。图6通过CCK-8实验检测在培养过程加入FSTL1对MSCs增殖的影响；图7通过细胞划痕、Transwell实验检测在培养过程加入FSTL1对MSCs细胞迁移的影响；A图为细胞划痕，B图为Transwell；图8通过实时定量PCR(A图所示)、Westernblot(B图所示)实验检测在培养过程加入FSTL1的MSCsCXCR4的表达量；通过实时定量PCR检测在培养过程加入FSTL1的MSCs中TNF-α、IL-6、IL-1β水平变化(C图所示)；图9通过流式细胞术检测在培养过程加入FSTL1的MSCs对巨噬细胞表型转化的影响。具体实施方式本专利技术的培养基是可用于培养MSCs的培养基，也叫MSCs专用培养基。本专利技术在培养基中添加卵泡抑素样蛋白1对间充质干细胞进行培养。为详细说明的技术方案和专利技术优势，下面结合附图和具体实施方式对本专利进行详细说明。实施例：实施例中所用材料来源说明：6-8周龄SPF级的C57BL/6购于南京大学模式动物研究所；人脐带MSCs由天津昂赛提供；流式抗体购买于BioLegend公司；Dir脂性染料购于ThermoFisherScientific，Transwell小室购买于美国康宁公司(Corning)，人源FSTL1重组蛋白购于R&D公司；人MSCs专用培养基购于R&D公司，其他细胞培养试剂购于LifeTechnology公司。本专利技术的改良型MSC的制备及体外表征。37℃5％CO2培养箱中利用人MSCs专用培养基人脐带MSCs(含1‰青霉素，1‰链霉素)，待汇合度达到90％，按1：2传代，继续培养待汇合度达到50％～60％；更换新鲜培养基并添加人源FSTL1重组蛋白1(终浓度为100ng/ml)，培养24h后收集细胞。利用流式细胞仪检测CD90、CD105、CD34相关标志物的表达情况。结果提示，添加FSTL1培养后没有改变MSCs主要表面标志物的类型(图1)；同时，利用实时定量PCR、Westernbl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改良型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，方法包括：采用添加有卵泡抑素样蛋白1的培养基培养间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
20190606 CN 20191049118491.一种改良型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，方法包括：采用添加有卵泡抑素样蛋白1的培养基培养间充质干细胞。


2.权利要求1所述的改良型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，采用添加有卵泡抑素样蛋白1的培养基培养间充质干细胞，所得间充质干细胞高表达CXCR4。


3.如权利要求1所述的改良型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于：大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、牛、羊、猪、马、...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩英，郑小红，周霞，王敬博，周新民，郭长存，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61