间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用制造技术

一种间充质干细胞来源的外泌体，对间充质干细胞进行间断缺氧刺激制得。本发明专利技术制得的外泌体具有更强的组织器官缺血‑再灌注损伤保护作用，提高了单位外泌体的生物学效应，更有利于对缺血性心脏疾病等的治疗。

【技术实现步骤摘要】
间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用
本专利技术涉及一种经诱导产生的细胞外膜泡，尤其是涉及一种经诱导产生的外泌体，具有特定的组成和含量，适用于组织修复，如：心肌组织。
技术介绍
作为旁分泌的重要媒介，外泌体(exosome)由于其特殊的生物学作用，越来越受到关注。外泌体是由活细胞分泌的膜泡，其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。由于外泌体在细胞外环境中可长期存在而不被降解或稀释，并且能通过组织液或血液输送到较远的靶细胞中，且外泌体几乎无免疫原性，不会发生排斥反应。因此，外泌体作为理想的信息传递分子可用于组织修复的调控，如：对心肌缺血再灌注损伤进行调控。为了对心肌缺血再灌注损伤的进行调控，有学者将研究着眼于间充质干细胞来源的外泌体对于心肌缺血再灌注损伤的修复作用，并取得了非常显著的成果。外泌体具有非常显著的临床转化优势。首先外泌体几乎没有抗原性，在目前的大规模外泌体研究中，大多是采用同种异体和异种异体的外泌体进行研究。外泌体在机体内不易募集免疫细胞的攻击，能够很好的包裹其内的内容物，作为一种极具潜力的药物载体，其能保护内容物而不至于在血液循环中被降解，具有极高的临床转化价值。此外，目前研究发现大多数具有分化潜能的细胞，诸如：骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪间充质干细胞(ADMSC)、诱导多功能干细胞等都具有改善心肌缺血再灌注损伤的保护作用。然而，外泌体的分离技术目前尚在逐步发展中，因此外泌体得率低是阻碍外泌体转化临床应用的一大难题。如何获得单位保护作用更显著(即使单位外泌体所携带更丰富的心肌细胞保护因子)外泌体成为了目前必须要面对的挑战。为此，通过参阅了近年来相关研究发现，目前对于外泌体的修饰多是采用慢病毒亦或是腺相关病毒在母体细胞中过表达某种已经证明对心肌缺血再灌注损伤有保护作用的蛋白分子、非编码RNA或通过脂质体、电穿孔等手段加载上述分子直接导入外泌体，进而提高单位外泌体对心肌损伤的保护作用。虽然，取得了一定的成效，但却对外泌体的临床应用转化设置了另外的一些障碍：一方面，外泌体其产生生物学作用是其内含物所产生的“合力”，单独的过表达或敲剪某单个分子，可能并不能在很大程度上产生外泌体生物学作用的变化；另一方面，目前提取外泌体的手段以及技术尚不成熟，得量不高，通过病毒感染或电穿孔等方式导入核酸进行外泌体修饰会对间充质干细胞生存状态产生影响，进而可能影响其外泌体合成的功能。第三，从临床转化角度而言，病毒感染等生物修饰手段目前存在很大的生物安全隐患，且成本过高，不利于临床转化。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种干细胞来源外泌体，其具有更高效、更显著的心脏保护作用。本专利技术的另一个目的在于提供一种外泌体的制备方法，通过物理干预手段，以求改变间充质干细胞所分泌的外泌体内所含心脏保护分子如miRNA丰度及表达谱。本专利技术的再一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备心肌缺血-再灌注损伤药物中的应用。本专利技术的又一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备心肌缺血-再灌注损伤器械中的应用。本专利技术的又一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平的药物中的应用。本专利技术的又一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞经过预处理，而分离获得的外泌体在制备调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平的器械中的应用。多种组织来源的间充质干细胞可应用于本专利技术。考虑到相较于其他间充质干细胞而言，在脂肪组织中间充质干细胞含量更高，而且ADMSC的固有生物学特征也较其他种类的MSCs更为稳定。就临床转化潜力而言，脂肪组织也是自体外泌体提取的最方便途径，也较其他组织来源的MSCs更容易被患者接受，因此具有较其他组织来源的MSCs无法比拟的临床转化潜力。在本专利技术中，优选选择ADMSC作为提取外泌体的母细胞，以及以此通过物理诱导的手段获得外泌体。一种间充质干细胞来源的外泌体，其主要含有microRNA224-5p。另一种间充质干细胞来源的外泌体，其主要含有microRNA224-5p与microRNA141-3p、microRNA34a-5p、microRNA23a-3p、microRNA130a-3p、microRNA23b-3p、microRNA200a-3p、microRNA93-5p、microRNA301a-3p和microRNA152-3p等非编码RNA，这些物质单独或组合具有心肌(细胞)保护作用的。本专利技术提供的间充质干细胞来源的外泌体对心肌缺血-再灌注损伤具有显著的修复的功能，对心脏保护作用更高效、更显著。本专利技术提供的间充质干细胞来源的外泌体能以细胞焦亡的机制调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平。将本专利技术提供的间充质干细胞来源的外泌体制成药物，用于调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平，实现对心肌缺血-再灌注损伤的修复。将本专利技术提供的间充质干细胞来源的外泌体施于载体(如：但不限于PLGA和金属等材料制成的支架)上制成医疗器械，用于调控心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的凋亡水平，实现对心肌缺血-再灌注损伤的修复。本专利技术的间充质干细胞来源的外泌体通过对间充质干细胞进行间断缺氧(即2次以上缺氧/复氧刺激，比如：至少缺氧→复氧→缺氧→复氧→缺氧→复氧共3个循环)干预制得，具有心肌保护作用。一种间充质干细胞来源的外泌体的制取方法，包括如下步骤：当P2～P3代的间充质干细胞汇合率达85％～90％时，通过缺氧小室对容器(如：培养皿)中的细胞进行间断的缺氧刺激，即通过缺氧→复氧→缺氧→复氧→缺氧→复氧共3个循环后，将细胞培养基更换为含有5v/v去除外泌体的胎牛血清的DMEM-F12完全培养基后于培养箱中孵育24小时～36小时后收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤(如：0.22μm)后，收集滤液；再将滤液置于300g～100000g转速下差速离心后获得沉淀，即为外泌体。缺氧，即将脂肪间充质干细胞置于缺氧小室中，把细胞培养基更换为无糖无血清的DMEM培养基后，对小室内通入80v/v％～95v/v％氮气和0v/v％～5v/v％二氧化碳的混合气体并通过氧电池检测缺氧小室内气体氧浓度直至氧气浓度为0v/v％后关闭小室通气阀门隔绝细胞糖分及氧气供应45分钟～60分钟。复氧，即打开缺氧小室阀门，并将培养基更换为具有糖分的DMEM-F12培养基后移入5v/v％二氧化碳、37℃培养箱中孵育1小时。为了提高外泌体的富集效率，一种具体的差速离心实施方式，4℃，分别于转速300g、2,000g、10,000g、100,000g和100,000g离心，最后所得沉淀即为外泌体。另一种具体的差速离心实施方式，4℃，分别于转速300g、2,000g、10,000g和100本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于对间充质干细胞进行间断缺氧刺激制得。/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于对间充质干细胞进行间断缺氧刺激制得。


2.根据权利要求书1所述的间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于主要含有microRNA224-5p，或含有microRNA224-5p与microRNA141-3p、microRNA34a-5p、microRNA23a-3p、microRNA130a-3p、microRNA23b-3p、microRNA200a-3p、microRNA93-5p、microRNA301a-3p、microRNA152-3p之一种或几种的组合。


3.根据权利要求书1或2所述的间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于具有更强的组织器官缺血-再灌注损伤保护作用。


4.根据权利要求书1或2所述的间充质干细胞来源的外泌体在制备对组织器官缺血-再灌注损伤修复的药物或器械中的应用。


5.一种对组织器官缺血-再灌注损伤修复的组合物，其特征在于以权利要求书1或2所述的间充质干细胞来源的外泌体为活性成分。


6.一种对组织器官缺血-再灌注损伤修复的医疗器械，其特征在于以权利要求书1或2所述的间充质干细胞来源的外泌体为活性成分。


7.一种制取1或2所述的间充质干细胞来源外泌体的方法，其特征在于包括如下步骤：
当P2～P3代的间充质干细胞汇合率达85％～90％时，通过缺氧小室...

【专利技术属性】
技术研发人员：王长谦，毛承誉，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31