【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，具体地，涉及一种血管化胰岛类器官及其构建方法和应用。
技术介绍
1、在成人胰腺中，大约有100万到300万个形状不规则的球状胰岛，其中产生胰岛素的β-细胞占50-70％。β细胞的主要功能不仅是分泌胰岛素，而且根据需要精确调节胰岛素的分泌，确保葡萄糖稳态的适当控制。胰岛的特点是具有致密的微循环系统，尽管仅占胰腺质量的1-2％，但胰岛可接受高达20％的胰腺动脉血流。胰岛内毛细血管由被周细胞包围的高度开孔的内皮组成，胰岛内内皮细胞的窗孔密度大约是周围外分泌胰腺组织的十倍。这种独特的特性确保了氧气、营养物质和代谢废物的快速交换的渗透性，同时促进了分泌激素的释放，进入循环，以调节葡萄糖水平。此外，胰岛内分泌细胞和血管细胞之间的相互作用在维持胰岛功能中起着至关重要的作用。糖尿病目前的治疗策略是外源性胰岛素治疗。然而，胰岛素替代疗法不能准确模拟天然胰岛提供的生理性血糖控制，用胰岛代替丢失和/或功能失调的β细胞是另外一种治疗选择，因为植入的细胞本身就能感知、响应和控制血糖水平。但是，尸体胰岛供体的严重短缺、对终身免疫抑制的需求以及胰岛制备过程中的变异性阻碍了其广泛的临床应用。因此构建血管化的胰岛类器官被认为是胰岛替代治疗的新思路。
2、现有技术中血管化胰岛类器官的构建主要有两种方式：1、第一种是采用组织工程方法、基于“种子细胞+生物支架”的原则进行构建，将种子细胞在体外传代扩增后，接种于生物支架，在体外诱导分化成胰岛细胞，这种组织构建的方法是基于“细胞”层面的；2、第二种是在体外培养阶段，将目的类器官与有助于
3、上述两种方式主要存在问题：细胞功能受损并且细胞外信号丢失：传统的基于细胞的胰岛类器官构建策略，在诱导分化前经历了复杂的处理，丢失了干细胞原有的高效自我增殖能力和多向分化潜能；在干细胞分化过程中也缺失了正常发育过程所包含的组织内细胞与细胞，细胞与细胞外基质的化学信号的指导，最终导致分化成具有胰岛功能的细胞效率低下。
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种血管化胰岛类器官及其构建方法和应用，所述构建方法利用脂肪组织直接构建的胰岛类器官，完全避免了提取干细胞、扩增干细胞、接种支架等步骤，取材便捷，操作省时简单，最大程度上保留了干细胞的自我增殖能力和多向分化潜能，并且在组织层面直接进行诱导分化，保留了组织内干细胞周围原有的组织成分，这有助于维持干细胞的功能，分化效率高。
2、本专利技术第一方面提供了一种血管化胰岛类器官的构建方法，包括以下步骤：
3、步骤(1)将人或动物的脂肪组织通过机械法制备成高细胞密度的微粒脂肪组织；
4、步骤(2)从人或动物的脂肪组织中通过酶消化法提取微血管片段；
5、步骤(3)制备自聚集脂肪组织；将高细胞密度的微粒脂肪组织与微血管片段按照预定比例混合，转移至悬浮培养系统中，加入培养基，悬浮培养1-10周，获得预血管化的自聚集脂肪组织；
6、步骤(4)胰岛类器官构建：制备的预血管化自聚集脂肪组织经过诱导分化培养基经过一段时间的体外诱导分化，转变为预血管化的胰岛类器官。
7、在本专利技术的一实施方式中，所述步骤(1)高细胞密度微粒脂肪组织制备的具体步骤包括：
8、(a)获取人/动物脂肪组织漂洗收集，在预定条件下离心；
9、(b)离心后获取预定数量的中间层固液混合物，依次通过不同预定条件下的脂肪组织切割器进行切割；
10、(c)获取最终切割结束的微粒脂肪组织，在预定条件下离心；
11、(d)获取离心后中间层预定数量的高密度微粒脂肪组织。
12、在本专利技术的一实施方式中，步骤(a)-(c)中的离心条件均为1000-5000g下离心1-10分钟。
13、在本专利技术的一实施方式中，脂肪切割器的孔径依次为5-10mm、2-5mm、0.5-2mm。
14、在本专利技术的一实施方式中，每个不同孔径的脂肪切割器的切割次数为10-50次。通过控制脂肪切割器的孔径和每个不同孔径的脂肪切割器的切割次数，提高细胞密度。
15、在本专利技术的一实施方式中，所述步骤(2)微血管片段提取的具体步骤包括：
16、(a)获取人/动物脂肪组织漂洗收集与胶原酶溶液等体积混合，在预定条件下振荡，离心；
17、(b)获取预定数量的下层液体加入至pbs缓冲液重悬微血管片段，获得微血管片段悬液；
18、(c)收集上层未消化脂肪，并重新与胶原酶溶液等体积混合，振荡，离心；
19、(d)重复多次步骤(b)(c)；
20、(e)混合多次获得的微血管片段悬液，离心，除去上清液，获得微血管片段。
21、在本专利技术的一实施方式中，步骤(e)中离心前，通过滤筛对微血管片段悬液进行过滤。
22、在本专利技术的一实施方式中，所述滤筛的孔径为40-600微米。
23、在本专利技术的一实施方式中，振荡条件为27℃-37℃、50-500rpm下，振荡3-15分钟。
24、在本专利技术的一实施方式中，离心条件为50-1000g下离心1-5分钟。
25、在本专利技术的一实施方式中，步骤(3)预血管化自聚集脂肪组织制备的具体步骤包括：
26、(a)按照预定比例混合高细胞密度微粒脂肪组织和微血管片段；
27、(b)在增殖培养基下，悬浮培养预定时间，获得自聚集脂肪组织；
28、(c)用钻孔器进行取样，获得小颗粒自聚集脂肪组织；
29、(d)继续在增殖培养基下，悬浮培养预定时间；
30、(e)自聚集培养结束后在成血管培养基下培养预定时间，从而获得预血管化的自聚集脂肪组织颗粒。
31、在本专利技术的一实施方式中，微血管片段和高密度微粒脂肪组织的混合比例为1×104-5×105个微血管片段/ml微粒脂肪组织。
32、在本专利技术的一实施方式中，增殖培养基包含memα、胎牛血清、青霉素-链霉素、hepes、sodium pyruvate、fgf-2、pdgf、地塞米松、抗坏血酸。
33、在本专利技术的一实施方式中，增殖培养基所包含的成分浓度为：1-10％胎牛血清、1-10％青霉素-链霉素、1-10％ hepes、1-10％丙酮酸钠、fgf-2(1-100ng/ml)、pdgf(1-200ng/ml)、地塞米松(10-5-10-7mol/l)、抗坏血酸(10-5-10-7mol/l)。
34、在本专利技术的一实施方式中，增殖培养时间为1-10周。
35、在本专利技术的一实施方式中，钻孔器的直径为0.5-5mm。
36、在本专利技术的一实施方式中，成血管培养基包含dmem、青霉素-链霉素、hepes、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、内皮细胞生长添加剂。
37、在本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的预血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)高细胞密度微粒脂肪组织制备的具体步骤包括：
3.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，步骤(a)-(c)中的离心条件均为1000-5000g下离心1-10分钟。
4.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，脂肪切割器的孔径依次为5-10mm、2-5mm、0.5-2mm。
5.根据权利要求4所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，每个不同孔径的脂肪切割器的切割次数为10-50次。
6.根据权利要求1所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)微血管片段提取的具体步骤包括：
7.根据权利要求6所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，步骤(e)中离心前，通过滤筛对微血管片段悬液进行过滤。
8.根据权利要求7所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，所述滤筛的孔径为40-600微米。
...【技术特征摘要】
1.一种血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的预血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)高细胞密度微粒脂肪组织制备的具体步骤包括：
3.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，步骤(a)-(c)中的离心条件均为1000-5000g下离心1-10分钟。
4.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，脂肪切割器的孔径依次为5-10mm、2-5mm、0.5-2mm。
5.根据权利要求4所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，每个不同孔径的脂肪切割器的切割次数为10-50次。
6.根据权利要求1所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)微血管片段提取的具体步骤包括：
7.根据权利要求6所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，步骤(e)中离心前，通过滤筛对微血管片段悬液进行过滤。
8.根据权利要求7所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，所述滤筛的孔径为40-600微米。
9.根据权利要求6所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，振荡条件为27℃-37℃、50-500rpm下，振荡3-15分钟。
10.根据权利要求6所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，离心条件为50-1000g下离心1-5分钟。
11.根据权利要求1所述的预血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，步骤(3)预血管化自聚集脂肪组织制备的具体步骤包括：
12.根据权利要求11所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，微血管片段和高密度微粒脂肪组织的混合比例为1×104-5×105个微血管片段/ml微粒脂肪组织。
13.根据权利要求12所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，增殖培养基包含memα、胎牛血清、青霉素-链霉素、hepes、sodium pyruvate、fgf-2、pdgf、地塞米松、抗坏血酸。
14.根据权利要求12所述的血管化胰岛类器官的构建方法，其特征在于，增殖培养基所包含的成分浓度为：1-10％胎牛血清...
【专利技术属性】
技术研发人员：李青峰，黄如林，杨京，阎羽欣，尹茜雅，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：
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