【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因沉默，具体涉及甘薯生长素响应因子arf基因沉默载体质粒及方法的构建与应用，更具体的是涉及arf基因沉默载体质粒的构建及其通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，vigs)的方法在甘薯基因功能研究或遗传育种中的应用。
技术介绍
1、植物生长素响应因子arf(auxinresponse factor)参与调节植物的众多生理反应,在植物生长发育过程中起到重要调控作用。甘薯是旋花科一年生草本植物，是重要的粮食作物和工业原料作物，其全基因组已经公布，在甘薯基因组网站上能够找到预测的甘薯的arf基因，但其基因功能尚未见报道。
2、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，vigs)是一种不依赖于转基因技术的基因功能缺失研究方法，可以简便、高效的沉默靶标基因。以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，trv)为介导的vigs体系具有侵染效率高、沉默时间长、引起的症状轻等诸多优势，是目前vigs技术中应用最广泛的病毒载体质粒。trv病毒具有两条rna链，分别是包含rna1组分(ptrv1)和rna2组分(ptrv2),trv诱导的基因沉默需要ptrv1和ptrv2两个载体质粒的共同作用。
3、基于trv的植物vigs体系已经在很多植物上获得了成功，但在甘薯基因功能的研究上，有关vigs应用的报道并不多；并且不同的vigs病毒载体质粒接种方法也会影响基因的沉默效率；因此，亟待建立一种trv介导的甘薯基因沉默方法，
技术实现思路
1、本专利技术公开了甘薯生长素响应因子arf基因沉默及方法的构建与应用，能够实现甘薯arf基因的高效沉默，进而为甘薯基因功能研究及遗传育种奠定基础。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、甘薯arf基因可用于调节甘薯不定根生长，arf基因部分片段的核苷酸序列如seqid no：1所示。
4、甘薯arf基因沉默载体质粒trv::arf，包括ptrv1和ptrv2-arf；
5、ptrv2-arf为ptrv2中插入seq id no：1所示arf基因的部分片段构建获得。
6、进一步地，ptrv2-arf的构建方法如下：
7、(1)根据seq id no：1所示甘薯的arf基因片段设计引入ecor i酶切位点和bamhi酶切位点的特异性引物，扩增arf基因部分片段；
8、(2)将步骤(1)获得的arf基因部分片段连接到t载体质粒上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒进行测序验证；
9、(3)采用ecor i和bamhi对ptrv2质粒与步骤(2)获得的阳性克隆质粒分别进行双酶切，将双酶切产物连接后转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，得到ptrv2-arf。
10、进一步地，引物包括：
11、上游引物
12、mq-arf-411-f：5’-cggaattctgggaattccaagcaggcaa-3’，seq id no：2，其中gaattc为ecor i酶切位点；
13、下游引物
14、mq-arf-411-r：5’-cgggatccctgcagcaagcagtccaatg-3’，seq id no：3，其中ggatcc为bamhi酶切位点。
15、甘薯arf基因沉默方法，包括如下步骤：
16、(1)选择“r”型甘薯茎段作为材料；“r”型甘薯茎段为带有两个节和一个腋芽的甘薯茎段；
17、(2)将权利要求2载体质粒ptrv1和ptrv2-arf分别转化农杆菌；
18、(3)分别将转入了载体质粒ptrv1和ptrv2-arf的农杆菌按1:1的体积比制成农杆菌混合液，依次加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和tween 20后制成农杆菌侵染液，对“r”型甘薯茎段进行减压处理，结束后再共培养以促进侵染；
19、(4)将步骤(3)侵染后的“r”型甘薯茎段清洗后再进行培养。
20、选择“r”型甘薯茎段作为材料时尽量保证茎段的生长状态相同、大小和粗细一致，能缩小不同茎段之间沉默效率的差异；且带有两个节有利于生根和成活，避免因茎段本身原因影响对基因功能的判断。
21、进一步地，步骤(1)选择“r”型甘薯茎段时，优选横切面直径约1-1.5cm，茎段形态学上端的切口为平切口，形态学下端的切口为楔形切口且呈30°夹角。
22、进一步地，步骤(3)转入载体质粒ptrv1和ptrv2-arf的农杆菌的od600均为1-1.2；
23、乙酰丁香酮、半胱氨酸、tween 20与转入载体质粒ptrv1和ptrv2-arf的农杆菌混合液的配比关系为：9.81mg：200mg：2.5ml：500ml。
24、进一步地，步骤(3)中的减压处理具体为：将“r”型甘薯茎段浸入农杆菌侵染液，在0.03mpa～0.05mpa压强下减压处理3min～5min。
25、减压处理时应注意减压处理的时长和压强，时间过长或压强过高都会导致茎段受到减压处理伤害严重甚至死亡，时间过短或压强过低都会导致农杆菌不足以进入茎段实现侵染，从而影响沉默效率。
26、进一步地，步骤(3)中的共培养具体为：将减压处理后的茎段继续浸泡在农杆菌侵染液中，使用封口膜封口，28℃、180rpm条件下恒温振荡培养30min～40min；共培养条件也会影响侵染。
27、进一步地，侵染时使用的农杆菌侵染液浓度od600值为1.0-1.2，浓度过高会使抽滤减压处理后的茎段感染病毒症状掩盖沉默表现型，严重甚至会引起死亡，浓度过低则达不到侵染的目的。
28、进一步地，步骤(4)中，将侵染后的“r”型甘薯茎段取出，无菌水冲洗2-3次，使用浓度为0.002mg/l的naa工作液遮光培养48h后，置于25℃、60％湿度、16h光照/8h黑暗的光周期下培养。侵染后的培养条件会影响基因沉默效率。
29、上述甘薯arf基因沉默载体质粒或甘薯arf基因沉默方法可用于甘薯基因功能研究或遗传育种。
30、综上所述，本专利技术通过构建甘薯arf基因沉默载体载体质粒以及基因沉默方法，可实现甘薯arf基因的高效沉默，arf基因被沉默后生根数减少，根长变短，证明本vigs体系在甘薯上取得了成功，甘薯vigs体系构建的成功将对甘薯基因功能的深入研究以及甘薯遗传育种研究具有重要价值。
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1.甘薯ARF基因在调节甘薯不定根生长中的应用，其特征在于，所述ARF基因部分片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.甘薯ARF基因沉默载体质粒，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的甘薯ARF基因沉默载体质粒，其特征在于，所述pTRV2-ARF的构建方法如下：
4.根据权利要求3所述的甘薯ARF基因沉默载体质粒，其特征在于，所述引物包括：
5.甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步骤(3)中的所述转入载体质粒pTRV1和pTRV2-ARF的农杆菌的OD600均为1-1.2；
7.根据权利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步骤(3)中的所述的减压处理具体为：将“r”型甘薯茎段浸入农杆菌侵染液，在0.03MPa～0.05MPa压强下减压处理3min～5min。
8.根据权利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步骤(3)中的所述的共培养具体为：将减压处理后的茎段继续浸泡在农杆菌侵染液中，使
9.根据权利要求5所述的甘薯ARF基因沉默方法，其特征在于，步骤(4)中，将侵染后的“r”型甘薯茎段取出，无菌水冲洗2-3次，使用浓度为0.002mg/L的NAA工作液遮光培养48h后，置于25℃、60％湿度、16h光照/8h黑暗的光周期下培养。
10.权利要求2-4任一项所述甘薯ARF基因沉默载体质粒或权利要求5-9所述甘薯ARF基因沉默方法在甘薯基因功能研究或遗传育种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.甘薯arf基因在调节甘薯不定根生长中的应用，其特征在于，所述arf基因部分片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。
2.甘薯arf基因沉默载体质粒，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的甘薯arf基因沉默载体质粒，其特征在于，所述ptrv2-arf的构建方法如下：
4.根据权利要求3所述的甘薯arf基因沉默载体质粒，其特征在于，所述引物包括：
5.甘薯arf基因沉默方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的甘薯arf基因沉默方法，其特征在于，步骤(3)中的所述转入载体质粒ptrv1和ptrv2-arf的农杆菌的od600均为1-1.2；
7.根据权利要求5所述的甘薯arf基因沉默方法，其特征在于，步骤(3)中的所述的减压处理具体为：将...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘起丽，李成伟，姜良良，郎剑锋，杜建峰，胡海燕，黄胜胜，王海荣，曾孙孟，雷闪闪，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：
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