一株稳定表达人源TLR8受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及稳定表达人源TLR8受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。该细胞系是指转入了人源TLR8基因的HEK293‑NF‑κB细胞，所述HEK293‑NF‑κB细胞是引入了NF‑κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。本发明专利技术也为研究TLR8配体在肿瘤治疗中的作用，以及利用RNA‑Seq技术高通量筛选hTLR8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究TLR8的种属特异性奠定了基础和平台。

【技术实现步骤摘要】
一株稳定表达人源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法
本专利技术属于生物
具体涉及稳定表达人源TLR8(hTLR8)受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。更具体地说，本专利技术提供能够用于研究hTLR8活化激活下游NF-κB启动子报告基因检测稳定细胞系。本专利技术也为研究TLR8配体在肿瘤治疗中的作用，以及利用RNA-Seq技术高通量筛选hTLR8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究TLR8的种属特异性奠定了基础和平台。
技术介绍
作为模式识别受体(Patternrecognitionreceptors,PRR)的重要组成，Toll样受体(Toll-likereceptors,TLR)在对抗入侵病原体的过程中起到了至关重要的作用，能够有效激活天然免疫和获得性免疫应答。TLR受体分子通过其胞浆区(Cytoplasmicdomain,CP)的TIR结构域聚合，招募具有同源结构域的接头分子MyD88，活化下游连接分子TRAF6和IKK、MEKK3等激酶，分别诱导细胞通过NF-κB途径产生促炎细胞因子和IRF途径产干扰素(IFN)。此外，TLR分子的结构组成还包括胞外区(EctodomainorExtracellulardomain,ECD)和跨膜区(Transmembrane,TM))[1]。TLR8属于一个由TLR7、TLR8、TLR9组成的亚家族，ECD包含26个LRR(Leucinerichrepeats，亮氨酸重复序列)基序，其中，LRR14和LRR15之间有一个30-40个氨基酸组成的功能未知区域(Z-loop)[1]。TLR8和TLR7由于序列的高度同源性，能够识别相似的配体：包括富含鸟苷、尿苷(GU)或poly-U的单链RNA(ssRNA)、双链siRNA和miRNA、小分子配体CL097和R848(resiquimod)等[2,3]。但小分子配体R837(imiquimod)、鸟苷酸类似物Loxoribine仅被人TLR7特异识别[4]。人TLR8(hTLR8)的ECD在果蝇细胞中被未知蛋白酶沿LRR14和LRR15之间的Z-loop切开，形成N-片段和C-片段后，hTLR8才能成熟并介导细胞信号，但TLR8ECD的纯化蛋白不管有无激活剂都以相似的二聚体晶体结构形式存在[3]。未活化时，TLR8ECD环形C端侧面上升处通过多个氢键和其他分子间作用力相互结合形成二聚体。hTLR8与配体结合时，每个配体都能被两个hTLR8夹持，且hTLR8的N端LRR11-14与另一个hTLR8*的C端LRR16-18交互作用[4,5]。hLTR8主要在髓系单核细胞、巨噬细胞和传统树突细胞(cDC)中分布表达，而在浆细胞样树突细胞(pDC)和B细胞中仅少量分布表达。同时，hTLR8还能够表达于肿瘤细胞，而肿瘤细胞TLR8的的激活主要与肿瘤免疫逃逸有关[6,7]。尽管TLR8刺激剂对肿瘤细胞的作用由于肿瘤细胞类型的不同而有所差异，但TLR8的激活能够活化NF-κB转录因子，从而上调凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进肿瘤细胞的增殖和存活，同时，降低了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，产生化疗抵抗作用[8,9]。参考文献1.WerlingD,JannOC,OffordV,GlassEJ,CoffeyTJ(2009)Variationmatters:TLRstructureandspecies-specificpathogenrecognition.TrendsImmunol30:124-130.2.WeiT,GongJ,JamitzkyF,HecklWM,StarkRW,etal.(2009)HomologymodelingofhumanToll-likereceptorsTLR7,8,and9ligand-bindingdomains.ProteinSci18:1684-1691.3.OhtoU,TanjiH,ShimizuT(2014)Structureandfunctionoftoll-likereceptor8.MicrobesInfect16:273-282.4.LiuJ,XuC,HsuLC,LuoY,XiangR,etal.(2010)Afive-amino-acidmotifintheundefinedregionoftheTLR8ectodomainisrequiredforspecies-specificligandrecognition.MolImmunol47:1083-1090.5.TanjiH,OhtoU,ShibataT,MiyakeK,ShimizuT(2013)StructuralreorganizationoftheToll-likereceptor8dimerinducedbyagonisticligands.Science339:1426-1429.6.ForsbachA,NemorinJG,MontinoC,MullerC,SamulowitzU,etal.(2008)IdentificationofRNAsequencemotifsstimulatingsequence-specificTLR8-dependentimmuneresponses.JImmunol180:3729-3738.7.CervantesJL,WeinermanB,BasoleC,SalazarJC(2012)TLR8:theforgottenrelativerevindicated.CellMolImmunol9:434-438.8.UmemuraN,ZhuJ,MburuYK,ForeroA,HsiehPN,etal.(2012)DefectiveNF-kappaBsignalinginmetastaticheadandneckcancercellsleadstoenhancedapoptosisbydouble-strandedRNA.CancerRes72:45-55.9.QianC,CaoX(2013)RegulationofToll-likereceptorsignalingpathwaysininnateimmuneresponses.AnnNYAcadSci1283:67-74.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定表达人源TLR8受体(hTLR8)基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。本专利技术建立在自主获得的hTLR8基因、克隆的pcDNA3.1(-)-hTLR8真核表达质粒和HEK293-NF-κB双荧光素酶稳定报告细胞系的基础上，构建能够稳定表达人源TLR8(hTLR8)受体基因的NF-κB双荧光素酶报告稳定细胞系。该细胞系既可以用于研究TLR8配体在肿瘤治疗中的作用，也可以用于后续RNA-Seq技术研究TLR8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因。本专利技术所采用的技术方案是：一种稳定表达人源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系，是指转入了人源TLR8受体基因hTLR8的HEK293-NF-κB细胞，所述HEK293-NF-κB细胞是引入了NF-κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定表达人源TLR8受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系，其特征在于，是指转入了人源TLR8受体基因hTLR8的HEK293‑NF‑κB细胞，所述HEK293‑NF‑κB细胞是引入了NF‑κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达人源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系，其特征在于，是指转入了人源TLR8受体基因hTLR8的HEK293-NF-κB细胞，所述HEK293-NF-κB细胞是引入了NF-κB虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的HEK293细胞。2.一种稳定表达人源TLR8受体基因的NF-κB双荧光素酶报告细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)含hTLR8基因的pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建：以人肠系膜淋巴结中提取总RNA反转录获得的cDNA为模板，利用特异性引物扩增hTLR8全长编码区基因，PCR产物纯化后利用NheI和EcoRV酶切，与同样酶切并带C-端HA标签的pcDNA3.1(-)连接后，获得含hTLR8基因的pcDNA3.1(-)真核表达载体；(2)HEK293-NF-κB双荧光素酶稳定报告细胞的构建：培养人胚肾细胞HEK293至融合度70％-80％，利用表达NF-κB虫荧光素FLuc的慢病毒感染HEK293细胞，感染细胞用10μg/ml杀稻瘟菌素筛选获得稳定表达NF-κ...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建中，夏芃芃，李双洁，敖大，陈南华，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32