γ-生育酚甲基转移酶及其基因和用途制造技术

一种来源于结球甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　Ｌ．Ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ　Ｌ．）的γ－生育酚甲基转移酶或其功能类似物，其氨基酸序列与ＳＥＱ　　ＮＯ．２所示的氨基酸序列具有至少有８０％的同源性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于γ-生育酚甲基转移酶(γ-tocopherolmethyltransferase，γ-TMT)基因工程领域。具体地说，涉及一种来自结球甘蓝(Brassica oleracea L.Var.capitata L.)的γ-生育酚甲基转移酶，及γ-生育酚甲基转移酶基因和其结构基因及其重组质粒；涉及其在植物中具有组成型或种子特异性表达的重组质粒，以提高植物和相应产品中α-生育酚的含量及改变α-生育酚的分布(特别是提高种子及油中α-生育酚的含量)；同时，还涉及在微生物中具有特异性表达γ-TMT的重组质粒，利用生物反应器催化生产α-生育酚。
技术介绍
维生素E(又称生育酚)分天然和合成两种。在天然存在的四种生育酚中，α-生育酚的生物活性最高(α-、β-、γ-、δ-生育酚的相对活性分别为100％，50％，10％和3％)。天然维生素E在化学上通常指α-生育酚，是仅由光合生物合成的一类脂溶性的抗氧化剂和营养补充剂。人体每天吸收7-9mg的α-生育酚是维持肌肉、中枢神经系统和血管系统正常生理功能所必需的。近20年来的临床研究表明，日吸收70-250mg的α-生育酚可提高免疫功能，防止或延缓许多人类退化性疾病的进程，降低患心血管疾病和某些癌症的危险，临床上可用于治疗老年性痴呆症、高血压、冠心病、心肌梗塞、动脉硬化、血栓及不育症等。随着人们对绿色食品、有机食品的逐步青睐，天然维生素E作为营养补充剂和抗氧化剂广泛应用于医药、保健品、食品、营养品、化妆品和饲料工业中。作物中α-生育酚水平的提高能延长新鲜和加工植物产品的货架时间及提高其稳定性。在食品中添加维生素E，不仅可以提高其营养价值，而且能防止食品中脂肪的氧化酸败，大大提高贮存期；在化妆品工业中，维生素E是防晒冷霜及精华素中的有效成分，在香波水中添加维生素E具有脱臭效果；此外，在猪、牛、家禽的饲料中添加维生素E，可显著提高肉的质量和延长加工后肉类产品的货架时间。随着近代医学和营养学的发展，一系列动物实验也已证实，α-生育酚(天然维生素E)被人体优先吸收和利用，无论是在生理活性上还是在安全性上均明显优于合成的维生素E，其活性约为合成维生素E的1.3-1.4倍，在国际市场上的价格约为合成的2-3倍。随着维生素E在医药、保健品、食品、营养品、化妆品和饲料等方面用途的不断扩大，天然维生素E的需求量不断增加，目前年消费量达3,000吨左右，年需求增长为10％。而我国目前的维生素E产品几乎全是合成品。α-生育酚主要是从植物油或其精炼副产品中提取的，α-生育酚的含量由植物种类决定。不同植物组织中生育酚的总量和成分差异很大，在绿色的叶片组织中，α-生育酚是含量最丰富的生育酚，但这些组织的总生育酚水平却非常低(10-50μg/g鲜重)。与光合组织不同，植物的非绿色组织(如大多数油料作物的种子)常含有高浓度的总生育酚(500-2,000μg/g鲜重)，但其中α-生育酚的含量很低(84-200μg/g鲜重)，绝大多数为它的生物合成前体——γ-生育酚，一些主要的植物油(如豆油、花生油、菜籽油)中α-生育酚的含量仅为7％-10％，而其生物合成前体——γ-生育酚却高达67％-70％。为此，改变作物及其产物中α-生育酚对γ-生育酚的比率，即提高了α-生育酚的含量和改变α-生育酚分布，特别是对提高种子及油中α-生育酚的含量有着十分重要的社会和经济效益。美国科学家仅仅从模式植物拟南芥及蓝藻中克隆了γ-TMT基因，在转γ-TMT基因拟南芥中α-生育酚含量有所提高。至今未见有从经济作物中获得γ-TMT的新基因，并将其转化到非模式植物的经济作物中去，以提高α-生育酚在作物和其产品中的含量和改变α-生育酚的分布的报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种具有序列表SEQ NO.1所示的核苷酸序列的γ-TMT基因(含结构基因)；具有序列表SEQ NO.2所示的氨基酸序列的一种γ-生育酚甲基转移酶及重组质粒p3END-T、p5END-T、pTMT。本专利技术的另一个目的是提供一种来自结球甘蓝(Brassica oleracea L.Var.capitata L.)的γ-TMT结构基因构建新的植物组成型表达重组质粒pBin-TMTL或种子特异性表达重组质粒p7S-TMTL，以及在微生物中特异表达的重组质粒pET-TMT；提供一种培育系列α-生育酚含量高的转基因植物，特别是油料作物如大豆、油菜、花生等，提高植物及其产品中α-生育酚的含量和改变α-生育酚分布(特别是指提高了种子及油中α-生育酚的含量)的新途径。本专利技术不仅将有助于人们从日常膳食中获得高水平的α-生育酚，达到增强体质，防病与保健相结合的目的，同时还可以大大降低工业化生产天然维生素E产品的成本，提高产品的产量和质量，在医药、保健品、食品、营养品、化妆品和饲料等方面具有广泛的应用前景。米用3’、5'-RACE及RT-PCR技术，从结球甘蓝(Brassica oleraceaL.Var.Capitata L.)实生苗顶芽中克隆了如序列表No.1所示的γ-TMT的全长cDNA序列。该cDNA长1,265bp，包含一个1,044bp的开放阅读框，编码包括叶绿体导肽(47个氨基酸)和两个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)在内如序列表No.2所示的347个氨基酸组成γ-TMT的蛋白质。该序列与美国科学家报道的模式植物拟南芥及蓝藻(Synechocystis PCC6803)的γ-TMT基因相比，核苷酸序列同源性分别为83.5％和37.7％，推导的氨基酸序列同源性分别为86.5％和41.8％，本专利技术首次从非模式植物中克隆得到的γ-TMT基因的cDNA全序列。本专利技术的γ-TMT基因编码的氨基酸与美国科学家报道的拟南芥的γ-TMT基因编码的氨基酸在一级结构上的主要差异在47个氨基酸的叶绿体导肽部分有22个氨基酸不同；在第二个功能区(10个氨基酸)有1个氨基酸不同；与蓝藻γ-TMT基因在氨基酸一级结构上的差异本专利技术所述的叶绿体导肽是47个氨基酸，蓝藻的细菌导肽是25个；其中只有7个氨基酸相同；在第一个功能区(9个氨基酸)有3个氨基酸不同；在第二个功能区有4个氨基酸不同。总的来说，三者在叶绿体导肽部分仅有3个氨基酸相同；在第一个功能区有3个氨基酸不同，在第二个功能区有4个氨基酸不同。应当指出的是，对本专利技术的γ-生育酚甲基转移酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本专利技术的目的，因而本专利技术也包括与Seq NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有γ-生育酚甲基转移酶90％的同源性，但同时具有γ-生育酚甲基转移酶活性的功能类似物。利用植物组成型表达载体pBin438和种子特异性表达载体p7S438构建了含该结构基因的重组植物组成型表达载体pBin-TMTL和重组植物种子特异性表达载体p7S-TMTL。经转化分别获得含pBin-TMTL和p7S-TMTL的重组大肠杆菌JM109和重组农杆菌LBA4404-Bin-TMTL、LBA4404-7S-TMTL、GV3101-Bin-TMTL和GV3101-7S-TMTL。以大豆无菌苗子叶节为外植体，经农杆菌介导，获得PCR、Sout本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡文启，欧阳青，韩天富，孙卉，樊春涛，张玉满，吴存祥，白羊年，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：