T细胞受体基因修饰小鼠制造技术

本发明专利技术提供了一种基因修饰的非人动物，在其基因组中包含未经重排的T细胞受体可变基因基因座，以及提供了包含该未经重排的T细胞受体可变基因基因座的非人胚胎、细胞和组织。还提供了用于制备所述基因修饰的非人动物的构建体以及制备所述基因修饰的非人动物的方法。本发明专利技术还提供了使用所述基因修饰的非人动物的多种方法。

T cell receptor gene modified mice

The invention provides a genetically modified nonhuman animal, which contains the unrearranged T cell receptor variable gene loci in its genome, and provides non-human embryos, cells and tissues containing the T cell receptor variable gene loci without rearrangement. The construction of the nonhuman animal for the preparation of the gene modification and the method for preparing the nonhuman animals modified by the gene are also provided. The invention also provides a variety of methods for the use of the gene modified nonhuman animals.

【技术实现步骤摘要】
T细胞受体基因修饰小鼠相关申请的交叉引用本申请是申请号为201280064216.3、申请日为2012年10月26日、专利技术名称为“T细胞受体基因修饰小鼠”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2012/062065的国家阶段申请，该国际申请要求美国临时申请号61/552,582，申请日为2011年10月28日；美国临时申请号61/621,198，申请日为2012年4月6日和美国临时申请号61/700,908，申请日为2012年9月14日的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。专利
本专利技术涉及基因修饰的非人动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，在所述动物的基因组中包含人源或人源化的T细胞受体(TCR)可变基因基因座(例如TCRα和TCRβ可变基因基因座和/或TCRδ和TCRγ可变基因基因座)，并且表达来自人源或人源化的TCR可变基因基因座的人源或人源化的TCR多肽(例如TCRα和TCRβ多肽和/或TCRδ和TCRγ多肽)。具有本专利技术的人源或人源化的TCR可变基因基因座的非人动物在内源性非人源TCR基因座包含未经重排的人源TCR可变区基因区段(例如V、D和/或J区段)。本专利技术还涉及胚胎、组织和细胞(例如T细胞)，其包含人源或人源化的TCR可变基因基因座并且表达人源或人源化的TCR多肽。本申请还提供了制备包含人源或人源化的TCR可变基因基因座的基因修饰非人动物的方法；以及使用包含人源或人源化的TCR可变基因基因座并且表达来自这些基因座的人源或人源化的TCR多肽的非人动物、胚胎、组织和细胞的方法。专利技术背景在适应性免疫应答中，通过B淋巴细胞(例如免疫球蛋白)和T淋巴细胞(例如T细胞受体或TCR)上的受体分子识别外来抗原。血液和细胞外空间中的病原体是在体液免疫应答过程中由抗体识别的，而在细胞内对病原体的破坏是在细胞免疫应答过程中由T细胞介导的。T细胞识别并攻击在主要组织相容性复合物(MHC)背景下递呈至细胞表面上的抗原。抗原识别由T细胞表面上表达的TCR介导。有两大类T细胞具有这种功能：细胞毒性T细胞，其表达细胞表面蛋白CD8，和辅助T细胞，其表达细胞表面蛋白CD4。细胞毒性T细胞活化信号级联导致递呈该抗原的细胞被直接破坏(在MHCI背景下)，而辅助T细胞分化成几种类型，并且其活化(在MHCII背景下通过识别递呈的抗原而激发)导致巨噬细胞介导的病原体破坏和刺激B细胞产生抗体。由于其具有抗原特异性，因而目前对抗体针对多种人类疾病的治疗潜力进行了广泛研究。为生成能够中和人类靶点的抗体，但避免同时激活针对这种抗体的免疫应答，科学家们集中精力在生产人源或人源化的免疫球蛋白上。在体内生产人源化的抗体的一种方法是使用小鼠，这种人源化小鼠包含(1)彼此之间可操作地连接的未经重排的人源免疫球蛋白V、D和J区段库，所述区段库和小鼠恒定区位于内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座，以及(2)彼此之间可操作地连接的未经重排的人源Vκ和Jκ区段库，所述区段库和小鼠恒定κ区位于内源性小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座。这样，小鼠提供了用于工程化制备人源抗体的高度多样化的重排抗体可变结构域的丰富来源。与抗体类似，T细胞受体包含可变区，其由包含V(D)J可变区区段的未经重排的基因座(α和β基因座，或者δ和γ基因座)编码，并且该可变区赋予了T细胞抗原结合特异性。亦与抗体类似，TCR对其抗原的特异性能够用于开发新疗法。因此，在本领域中需要非人动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)，所述动物包含能够重排以形成编码人源T细胞受体可变结构域基因的未经重排的人源T细胞可变区基因区段，包括彼此间同源的结构域和与目的抗原特异性结合的结构域。还需要一种包含T细胞可变区基因座的非人动物，所述基因座包含保守的人源化，其包括包含未经重排的人源基因区段的非人动物，所述人源基因区段能够重排以形成与非人源(内源性)T细胞受体恒定基因序列连接的T细胞受体可变区基因。还需要能够生成多样性的人源T细胞受体可变序列库的非人动物。需要在对目的抗原应答时能够重排大部分或全部功能性T细胞受体可变区区段以形成包含完全人源可变结构域的T细胞受体多肽的非人动物。专利技术概述本申请提供了非人动物例如啮齿动物，所述动物包含表达在细胞免疫应答中具有功能的人源化的分子的非人源细胞。本申请还提供了包含未经重排的TCR可变基因基因座的非人动物。本申请提供了体内和体外系统，所述系统包含人源化的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞表达一种或多种人源化的免疫系统分子。本申请还提供了编码人源化的TCR蛋白的未经重排的人源化的TCR啮齿动物基因座。在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述动物在其基因组中包含(a)未经重排的TCRα可变基因基因座，其包含与非人源(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)TCRα恒定基因序列可操作地连接的至少一个人源Vα区段和至少一个人源Jα区段，和/或(b)未经重排的TCRβ可变基因基因座，其包含与非人源(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)TCRβ恒定基因序列可操作地连接的至少一个人源Vβ区段、至少一个人源Dβ区段和至少一个人源Jβ区段。在一个实施方式中，所述未经重排的TCRα可变基因基因座取代在内源性TCRα可变基因基因座的内源性非人源(例如啮齿动物)TCRα可变基因基因座。在一个实施方式中，所述未经重排的TCRβ可变基因基因座取代在内源性TCRβ可变基因基因座的内源性非人源(例如啮齿动物)TCRβ可变基因基因座。在一个实施方式中，所述内源性非人源(例如啮齿动物)Vα和Jα区段无法重排以形成经重排的Vα/Jα序列。在一个实施方式中，所述内源性非人源(例如啮齿动物)Vβ、Dβ和Jβ区段无法重排以形成经重排的Vβ/Dβ/Jβ序列。在一个实施方式中，所述非人动物包含缺失以使得所述动物的基因组不包含功能性Vα和功能性Jα区段。在一个实施方式中，所述非人动物包含缺失以使得所述动物的基因组不包含功能性内源性Vβ、功能性内源性Dβ和功能性内源性Jβ区段。在一个实施方式中，所述动物包含全部功能性内源性Vα和Jα区段的缺失。在一个实施方式中，所述啮齿动物包含全部功能性内源性Vβ、Dβ和Jβ区段的缺失。在一些实施方式中，所述人源Vα和Jα区段重排以形成经重排的Vα/Jα序列。在一些实施方式中，所述人源Vβ、Dβ和Jβ区段重排以形成经重排的Vβ/Dβ/Jβ序列。因此，在不同实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物)在T细胞表面表达包含人源可变区和非人源(例如啮齿动物)恒定区的T细胞受体。在一些方面，所述非人动物的T细胞在胸腺中经历T细胞发育以产生CD4和CD8单阳性T细胞。在一些方面，所述非人动物包含正常的脾脏CD3+T细胞与总脾脏细胞的比率。在不同实施方式中，所述非人动物在外周生成中心和效应记忆T细胞群。在一个实施方式中，在本申请所描述的非人动物中未经重排的TCRα可变基因基因座包含61个人源Jα区段和8个人源Vα区段。在另一个实施方式中，在非人动物中未经重排的TCRα可变基因基因座包含完整的人源Jα区段库和完整的人源Vα区段库。在一个实施方式中，在本申请所描述的非人动物中未经重排的TCRβ可变基因基因座包含14个人源Jβ区段、2个人源Dβ区段和14个人源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的非人动物细胞，其包含：未经重排的T细胞受体(TCR)α可变基因基因座，其包括至少一个人源Vα区段和至少一个人源Jα区段，其中所述未经重排的TCRα可变基因基因座与非人源TCRα恒定基因序列可操作地连接，其中所述未经重排的TCRα可变基因基因座取代内源性非人源TCRα可变基因基因座，和/或未经重排的TCRβ可变基因基因座，其包括至少一个人源Vβ区段、至少一个人源Dβ区段和至少一个人源Jβ区段，其中所述未经重排的TCRβ可变基因基因座与非人源TCRβ恒定基因序列可操作地连接，其中所述未经重排的TCRβ可变基因基因座取代内源性非人源TCRβ可变基因基因座。

【技术特征摘要】
2011.10.28 US 61/552,582;2012.04.06 US 61/621,198;1.一种分离的非人动物细胞，其包含：未经重排的T细胞受体(TCR)α可变基因基因座，其包括至少一个人源Vα区段和至少一个人源Jα区段，其中所述未经重排的TCRα可变基因基因座与非人源TCRα恒定基因序列可操作地连接，其中所述未经重排的TCRα可变基因基因座取代内源性非人源TCRα可变基因基因座，和/或未经重排的TCRβ可变基因基因座，其包括至少一个人源Vβ区段、至少一个人源Dβ区段和至少一个人源Jβ区段，其中所述未经重排的TCRβ可变基因基因座与非人源TCRβ恒定基因序列可操作地连接，其中所述未经重排的TCRβ可变基因基因座取代内源性非人源TCRβ可变基因基因座。2.根据权利要求1所述的分离的非人动物细胞，其中所述细胞是胚胎干细胞。3.一种分离的非人动物细胞，包括重排的人源Vα/Jα序列和/或重排的Vβ/Dβ/Jβ序列，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·麦克唐纳，A·J·莫菲，J·麦克沃克，N·图，V·沃罗宁那，C·古雷尔，K·梅格尔，S·史蒂文斯，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US