一种AFP重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其应用。该rAAV是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为肿瘤抗原基因AFP或其突变型基因得到。本发明专利技术的rAAV可将其携带的野生型或突变型的甲胎蛋白基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明专利技术的rAAV感染的DC所诱导的CTL在患者体内可有效地抑制恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明专利技术的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗肝癌的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术为分案申请。原申请日为2008年4月23日，申请号200880012949.6，专利技术名称为“一组重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用”。
本专利技术涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种AFP重组腺相关病毒载体及其构建方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ，Srivastava A，Berns KI，Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids：gene correction within the terminal repeats of AAV.Cell.33：135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(Hermonat PL，Labow MA，Wright R，Berns KI，Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus：isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2 mutants.J Virol.51：329-339.Hermonat，P.L.，and Muzyczka，N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector：transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子(Labow MA，Hermonat PL，Berns KI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type2 genome.J Virol.160：251-258.)。 1984年，美国博沃基因国际有限公司的主要技术技术负责人之一Paul L.Hermonat教授率先证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗(Hermonat，P.L.，and Muzyczka，N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector：transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6466-6470.)。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病有帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。但是，应用于临床治疗的AAV病毒仍存在一些问题，例如携 带治疗基因大小受到明显限制，病毒本身不稳定，导致治疗基因表达不稳定，以及造成疗效不一致。虽然AAV病毒本身的免疫原性很弱，但所表达的治疗基因容易在患者体内诱发自身免疫反应，甚至导致严重的毒副作用。 AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括与病毒复制有关的Rep基因和病毒衣壳Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)。现有大量研究表明，将AAV基因组中的结构基因删除，可明显增加外源性基因的容量。此外，将具有治疗作用的外源性基因插入rAAV中，制备成具有感染性的rAAV病毒颗粒，注射入患者体内，使其感染体内细胞，进而表达治疗基因，从而达到治疗疾病的作用。目前，主要是将rAAV应用于帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病的治疗。但rAAV仍然存在一些不足，如重组病毒不稳定，病毒滴度低，接纳治疗基因的容量仍然有限(一般仅能插入的外源性基因片段最大约2000碱基对(bp)，否则rAAV的稳定性将被破坏)。因此，需要设计更为合理的重组腺相关病毒(rAAV)载体，以满足实际应用的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定性高、携带外源性基因容量大的AFP重组腺相关病毒(rAAV)载体。 本专利技术所提供的重组腺相关病毒载体， 是将腺相关病毒(AAV)载体中的腺相关病毒结构基因替换为甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)基因或其突变型基因得到的重组腺相关病毒载体。 本专利技术的AFP重组腺相关病毒载体是在已知的腺相关病毒载体的基础上进行改造得到的，所述腺相关病毒结构基因为Rep和Lip/Cap基因，肿瘤特异抗原基因AFP为肿瘤相关抗原基因，其突变型基因是具有相同功能的相关肿瘤特异抗原基因片段。 已知的腺相关病毒载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子。 本专利技术的第二个目的是提供上述AFP重组腺相关病毒载体的构建方法。 本专利技术所提供的构建方法，是使用常规的基因重组的方法，先将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因剔除，再用前述特异抗原基因AFP或其突变型基因m AFP取代该剔除基因，得到AFP重组腺相关病毒载体。 在上述AFP重组腺相关病毒载体的构建方法中，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta 肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子。 与本专利技术AFP重组腺相关病毒载体相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被本专利技术重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，如单核细胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系等(所述AFP重组腺相关病毒载体中的相关基因或其突变型基因可在单核细胞-树突状细胞系或T淋巴细胞系等细胞系中在转录启动子的作用下获得表达)等均属于本专利技术的保护范围。 医药用途方面，本专利技术的另一个目的是提供一种抗肿瘤药物本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ＡＦＰ重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为甲胎蛋白（ａｌｐｈａ ｆｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＦＰ）基因或其突变型基因得到的重组腺相关病毒载体。
【技术特征摘要】
2007.04.23 CN 200710097935.61.一种AFP重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基
因替换为甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)基因或其突变型基因得到的重组腺相
关病毒载体。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将所述重组腺相
关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40
病毒启动子中的一个或几个启动子。
3.一种构建权利要求1所述重组腺相关病毒载体的方法，是先将腺相关病毒载
体中的腺相关病毒结构基因剔除，再用所述肿瘤抗原AFP基因或其突变型基因取代该
剔除基因，得到重组腺相关病毒载体。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括将所述重组
腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta肌动蛋白启动子和
SV40病毒启动子中的一个或几个启动子的步骤。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
A.pBR-AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将pBR-AAV2质粒
中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限
制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质
粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均
插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；
B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；
C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长AFPcDNA和部分AFPcDNA片段；
D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动
蛋白启动子、全长AFPcDNA或部分AFPcDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2
载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启
动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长AFPcDNA的AFP重组腺相关病
毒载体(命名为rAAV/AFP)，或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋
白启动子和AFP cDNA片段的突变型AFP重组腺相关病毒载体(命名为rAAV/m AFP)。
6.与权利要求1或2所述或权利要求3或4或5所述方法制备得...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，张文杰，
申请(专利权)人：核力康健生物医药技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：12
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