抗咽喉炎特异性复合IgY及其制剂制造技术

本发明专利技术公开一种抗咽喉炎特异性复合ＩｇＹ及其制备方法和制剂。本发明专利技术抗咽喉炎特异性复合ＩｇＹ通过优选具高免疫应答能力的良种鸡，用全菌和菌体成份的复合抗原，分别对优选的特种鸡进行强化免疫，检取强化免疫鸡所产免疫蛋，制得抗咽喉炎复合ＩｇＹ粗提物干粉成品，ＩｇＹ粗提物进行纯化，即得纯ＩｇＹ。用本发明专利技术ＩｇＹ制备的抗咽喉炎口喷制剂无化学有害物质、天然安全并可直接喷服。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种复合IgY及其制备方法和制剂，特别是涉及一种抗咽喉炎特异性复合IgY及其制备方法和制剂
技术介绍
当前国内外治疗细菌引起的咽喉炎和扁桃腺炎等疾病的方法主要使用抗生素，此方法效果好，但存在几个问题。一是耐药菌株导致治疗无效，抗生素失效已成为全球性问题，其中中国上海和香港两地有75％以上的抗生素已失效。二是可能诱发抗药菌株的产生，“细菌越来越耐药，抗生素越来越失效”是经济较发达地区的普遍问题。三是将口腔和咽喉的有益细菌也杀灭了，导致菌群失调，破坏微生态平衡，产生不良后果；四是可引致腹泻、敏感反应、真菌感染等副作用。使用中草药制剂治疗细菌引起的咽喉炎和扁桃腺炎等疾病也很多见，如草珊瑚含片、冰硼咽喉片、西瓜霜润喉片、喉宝等。这些药剂舒缓症状作用较其抗菌疗效更为突出。蒸气吸入疗法也是临床常用方法之一，仍以缓和症状作为治疗目的。因此目前对咽喉炎和扁桃腺炎尚没有理想而又无副作用的治疗药物。IgY(Immunoglobulin of yolk)属IgG类免疫球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(如某些细菌)的状态或活性；能通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌的吞噬；能与病毒结合，改变病毒表面的构象，阻止病毒吸附于易感细胞，同时，形成的病毒——IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种直接抑制或杀死咽喉炎(pharyngolaryngitis)致病菌的特异性IgY及其制备方法；本专利技术的目的还在于提供一种直接抑制或杀死咽喉炎(pharyngolaryngitis)致病菌的特异性IgY制成的天然安全而又具有特效作用的、防治咽喉炎和扁桃腺炎的制剂。本专利技术目的是通过如下技术方案实现 (1)优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原(约20亿个以上细菌)。在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后采用本公司已公开的专利技术(专利申请号00101270.3，专利公开号1307061)分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为本专利技术优选的高免疫应答能力的特种鸡；上述母鸡可以选自明星鸡、莱航鸡、褐兰鸡、罗曼鸡；(2)复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占40-60％，肺炎双球菌占35-25％，金黄色葡萄球菌占25-15％，的比例混合匀化或者按A簇B型溶血型链球菌占45-30％，肺炎双球菌占15-25％，G簇溶血性链球菌占10-15％，金黄色葡萄球菌占10-20％，白色葡萄球菌占20-10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；(3)分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；(4)抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品；(5)抗咽喉炎IgY的纯化采用本公司已公开的专利技术(专利申请号00101270.3，专利公开号1307061)分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗咽喉炎IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗咽喉炎IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量为50％以上。采用本专利技术的特殊免疫激活方法和改进的工艺技术所制得的抗咽喉炎复合IgY粗提物参照上述“ELISA法”进行活性检测，对A簇和G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、白色葡萄球菌等五种致病菌抗体结合效价达到1∶256以上，对其它跟这5种细菌有“共同抗原决定簇”的同属不同种或同种不同簇和不同型的细菌的抗体结合效价也达到1∶128以上。0.02-80％的复合IgY粗提物或者其纯化物配以99.98-20％的辅料，可制成临床可接受的剂型，如口含片、滴鼻剂、鼻喷剂、口喷剂等剂型的产品。特别是以抗咽喉炎复合IgY粗提物或其纯化物为主要成份配制成新型喷雾剂或口含片，本专利技术将其设计直接施于致病菌最集中的咽喉部位，作用直接，疗效好、见效快；同时，它克服了常规施药方式要使药物进入人体循环后才产生作用而会给人体带来种种不良影响的弊病。本专利技术所制备的抗咽喉炎复合IgY是一种独特的纯天然生物制剂，使用十分安全，无任何毒副作用。由于它仅仅针对咽喉炎和扁桃腺炎的致病病原体直接产生强烈的抑制作用，对有益菌却有很好的保护作用；同时，它完全不会诱发抗药菌株的产生，也不会象“抗生素”或其他常规药物那样，将有益菌群也和病原体一起都抑灭而造成“菌群失调”；反之，抗咽喉炎复合IgY可以在咽喉部位构建一种不产生炎症的正常菌群生态，达到既治疗又预防的双重目的。实验例1以单一A簇溶血性链球菌、单一金黄色葡萄球菌、A簇溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌混合，分别制成三种不同抗原免疫母鸡，并分别按上述方法制取三种不同IgY。然后各自参照“ELISA法”检测其抗体结合效价。 比较分析以上试验后，我们发现采用几种致病菌制成复合抗原，再用这种复合抗原免疫母鸡所制得的复合IgY，对复合抗原的结合效价比对单一抗原的结合效价高。由于咽喉部位的致病菌很少是单一发生作用的，都是由几种致病菌综合作用才产生炎症等症状，例如，金黄色葡萄球菌在咽喉部位存在，只是有条件致病菌，它单独存在并不一定会导致咽喉炎症，只有当溶血性链球菌作祟时，它才会跟着起作用。因此，以复合抗原免疫母鸡，所制得的复合IgY，对于由多种致病菌引致的疾病，效果比采用单一抗原免疫母鸡所制备的IgY要好得多。实验例2筛选高免疫应答的鸡种以A簇溶血性链球菌制作抗原，用同一剂量、同一注射方式分别免疫法国“明星鸡”、意大利“莱航鸡”、美国“罗曼鸡”；然后分别从这些不同种的母鸡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗咽喉炎复合ＩｇＹ粗提物，其特征在于该ＩｇＹ粗提物是由如下方法制备的：优选具高免疫应答能力的良种鸡：用Ａ簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射１ｍｌ抗原在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第７个月，把 这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的ＩｇＹ，以ＥＬＩＳＡ法检测所制得的ＩｇＹ的效价；再比较其效价，选出其中能制得ＩｇＹ效价≥１∶１２８的免疫应答能力特别强的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至２－３个月，作为本专利技术优选的高免疫应答能力的特种鸡；复合抗原的制备：选取Ａ簇Ｂ型溶血性链球菌、肺炎双球菌、Ｇ簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按Ａ簇 Ｂ型溶血型链球菌占４５－３０％，肺炎双球菌占１５－２５％，Ｇ簇溶血性链球菌占１０－１５％，金黄色葡萄球菌占１０－２０％，白色葡萄球菌占２０－１０％的比例混合匀化；按１∶１的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；分别对优选的特种鸡进行强化免疫：用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到１－２ｍｌ抗原 ，相当于３０－６０亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射２０天后，检取鸡所产免疫蛋；抗咽喉炎复合ＩｇＹ粗提物的制备：用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积， 按此体积的４－６倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用ＮａＯＨ溶液调整ｐＨ至５．５－６．０之间；将调整好ｐＨ值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至２－６℃，静置１２小时－２４小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离２０分钟；将分 离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩１０－２０倍，按０．１～０．３％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合ＩｇＹ粗提物干粉成品。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡义结，杨荣，包海威，包晟，
申请(专利权)人：雅臣药业集团远东有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]