黑鲷抗菌肽Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的表达载体和表达产物及其构建制备方法技术

黑鲷抗菌肽Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的表达载体和表达产物及其构建制备方法，涉及一种可高效表达黑鲷抗菌肽Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的表达载体的构建与表达。黑鲷抗菌肽Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的表达载体是在含有Ｅ．ｃｏｌｉＴｒｃ启动子、蛋白质工程改造过的ＣＫＳ基因及组氨酸标签（Ｈｉｓ－Ｔａｇ）的原核表达载体ｐＴｒｃ－ＣＫＳ上连接黑鲷Ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因所构建成的ｐＴｒｃ－ＣＫＳ／ｈｅｐｃｉｄｉｎ表达质粒，具有Ｐ３Ｃ酶切割位点，Ｃ术端融合６个组氨酸。其融合表达产物ＣＫＳ－ｈｅｐｃｉｄｉｎ可通过Ｃ末端Ｈｉｓ－Ｔａｇ亲和层析纯化，纯化的融合产物可用Ｐ３Ｃ酶将融合蛋白中的ＣＫＳ切除，获得纯化的Ｈｅｐｃｉｄｉｎ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中的鱼类基因工程，尤其是具有抗菌活性的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体的构建及其制备方法。
技术介绍
Hepcidin是一个在C端保守位点上富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族。它们的C末端都保留了半胱氨酸形成的富集区，CD(circular dichroism，圆二色)光谱学特性研究证实，在磷酸缓冲液中hepcidin具有两个稳定的β折叠结构，这一结构与抗菌多肽的胱氨酸(cystin-eknot)结构非常相似。富含半胱氨酸的抗菌肽已在昆虫的脂肪体、软体动物和甲壳动物的血淋巴、哺乳动物的上皮细胞和循环细胞如嗜中性粒细胞、巨噬细胞中分离出来。此类抗菌肽有抗真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性。2000年，Krause et al(Krause A，Neitz S，MagertHJ，Schulz A，Forssmann WG，Knappe PS，Adermann K.LEAP-1，a novel highly disulfide-bonded human peptide，exhibits antimicrobial activity.FEBS Lett.，2000，480147-150)最早从人类血浆中首先发现了LEAP-1(后称为hepcidin)，曾用化学合成该多肽检测了hepcidin的抗菌活性，结果发现hepcidin能够剂量依赖性(Dose-dependent)的抑制革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和革兰氏阴性菌灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)的生长，但是对大肠杆菌(E.coli BL21 G-)和萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens G-)没有活性，此hepcidin对枯草芽孢杆菌的半数抑制浓度(half-maximal inhibitoryactivity，IC50)为40μg/ml(14.4μM)。而Park et al(ParkCB，Lee JH，Park IY，Kim MS，Kim SC.A noval antimicrobial peptide from the loach，Misgurnus anguillicaudatus.FEBS Lett.，1997，411173-178.)从人类尿液中分离的Hep20和Hepc25天然产物，在30μM浓度下对大肠杆菌(E.coli ML35P G-)的生长则具有较强的抑制作用，对金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长抑制作用较弱，对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa G+)没有抑制作用。鱼类抗菌肽的研究加深了人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识，为日益严重的鱼类病害防治开辟了崭新的途径。抗菌肽药物在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌和治疗药物，因而获得高产量的抗菌肽是其在水产养殖业推广应用的前提，但直接从鱼类提取或利用化学方法人工合成天然的抗菌肽，受动物来源和化学合成方法的局限，很难获得足够量的抗菌肽，且费用昂贵。利用分子生物学技术可以克隆获得海水养殖鱼类的抗菌肽基因，通过建立海水养殖鱼类抗菌肽基因表达工程菌，可以在体外产业化生产抗菌肽；而用抗菌肽产品替代抗生素添加到饲料，饲喂海水养殖鱼类，不仅可以提高鱼体的免疫抗病力，增加其产量，同时还可以避免抗生素在鱼体中的蓄积，提高水产品质量，从而解决目前困扰我国海水养殖生产中的细菌耐药性及水环境和水产品抗生素污染等问题。由于hepcidin多肽含有8个半胱氨酸，具有特殊的4个二硫键结构，通过化学合成该多肽技术难度很大、费用昂贵，因而不能满足产业化要求，可行有效的途径是在体外通过基因工程菌表达该抗菌肽，但技术上也存在难度和风险，因此目前关于这方面的研究报道很少。Zhang et al(Zhang H，Yuan QP，Zhu YP，Ma RY.Expression and preparation of recombinanthepcidin in Escherichia coli.Protein.Expr.Purif.，2005，41409-416.)曾经利用合成的人类hepcidin核酸片段重组到pGEX-hpc表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，但其表达产物是以包涵体形式存在，需要经过复性过程才能获得有生物活性的hepcidin，因而利用pGEX-hpc这一类表达载体制备hepcidin的工艺相对复杂，成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在通过构建一种含有黑鲷hepcidin(eDNA)的pTrc-CKS/hepcidin表达载体(原核表达载体pTrc-CKS购自晶美生物有限公司)以及在E.coli TOP10F′中的诱导表达可溶性产物和高效纯化可溶性表达产物的方法，从而可大量地体外获得抗菌肽hepcidin的表达产品。本专利技术所述的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体是在含有E.coli Trc启动子、蛋白质工程改造过的CKS基因及组氨酸标签(His-Tag)的原核表达载体pTrc-CKS(购自晶美生物有限公司)上连接黑鲷Hepcidin基因(Genbank登录号AY669377)所构建成的pTrc-CKS/hepcidin表达质粒，具有P3C酶切割位点，C末端融合6个组氨酸。其可溶性融合表达产物CKS-hepcidin可通过C末端His-Tag亲和层析纯化，纯化的融合产物可用P3C酶将融合蛋白中的CKS切除，从而获得纯化的Hepcidin。通过计算得知，pTrc-CKS空载体诱导表达的蛋白为268aa，理论分子量为29.0kDa；pTrc-CKS/hepcidin重组载体诱导表达的蛋白为328aa，理论分子量为36.3kDa。pTrc-CKS/hepcidin表达质粒的碱基序列如下agcatgccag actctctcga agttctgttt cagggtccag caggatctgg ctcattcact780gaggtgcaag agccggagga gccaatgaac aatgagagtc cagttgctgc acatgaagag840 aagtcagagg agtcctggaa gatgccgtat aacaacagac acaagcgcag ccccgctggt900tgtcgctttt gctgcggttg ctgtcctaac atgagaggat gtggtgtctg ctgcaggttc960tctagccacc atcatcatca tcat 984氨基酸序列如下↓P3C切点Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser Gly Ser PheThr Glu Val Gln Glu Pro Glu Pro Met Asn Asn Glu Ser Pro Val Ala Ala His GluGlu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn本文档来自技高网...

【技术保护点】
黑鲷抗菌肽Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的表达载体，其特征在于所述的黑鲷抗菌肽Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的表达载体是在含有Ｅ．ｃｏｌｉＴｒｃ启动子、蛋白质工程改造过的ＣＫＳ基因及组氨酸标签的原核表达载体ｐＴｒｃ－ＣＫＳ上连接黑鲷Ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因所构建成的ｐＴｒｃ－ＣＫＳ／ｈｅｐｃｉｄｉｎ表达质粒，具有Ｐ３Ｃ酶切割位点，Ｃ末端融合６个组氨酸，ｐＴｒｃ－ＣＫＳ／ｈｅｐｃｉｄｉｎ重组载体诱导表达的蛋白为３２８ａａ；其碱基序列如下：ａｇｃａｔｇｃｃａｇａｃｔｃｔｃｔｃｇａａｇｔｔｃｔｇｔｔｔｃａｇｇｇｔｃｃａｇｃａｇｇａｔｃｔｇｇｃｔｃａｔｔｃａｃｔ７８０ｇａｇｇｔｇｃａａｇａｇｃｃｇｇａｇｇａｇｃｃａａｔｇａａｃａａｔｇａｇａｇｔｃｃａｇｔｔｇｃｔｇｃａｃａｔｇａａｇａｇ８４０ａａｇｔｃａｇａｇｇａｇｔｃｃｔｇｇａａｇａｔｇｃｃｇｔａｔａａｃａａｃａｇａｃａｃａａｇｃｇｃａｇｃｃｃｃｇｃｔｇｇｔ９００ｔｇｔｃｇｃｔｔｔｔｇｃｔｇｃｇｇｔｔｇｃｔｇｔｃｃｔａａｃａｔｇａｇａｇｇａｔｇｔｇｇｔｇｔｃｔｇｃｔｇｃａｇｇｔｔｃ９６０ｔｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔ９８４氨基酸序列如下：↓Ｐ３Ｃ切点ＳｅｒＭｅｔＰｒｏＡｓｐＳｅｒＬｅｕＧｌｕＶａｌＬｅｕＰｈｅＧｌｎＧｌｙＰｒｏＡｌａＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＰｈｅＴｈｒＧｌｕＶａｌＧｌｎＧｌｕＰｒｏＧｌｕＰｒｏＭｅｔＡｓｎＡｓｎＧｌｕＳｅｒＰｒｏ　ＶａｌＡｌａＡｌａＨｉｓＧｌｕＧｌｕＬｙｓＳｅｒＧｌｕＧｌｕＳｅｒＴｒｐＬｙｓＭｅｔＰｒｏＴｙｒＡｓｎＡｓｎＡｒｇＨｉｓＬｙｓＡｒｇＳｅｒＰｒｏＡｌａＧｌｙＣｙｓＡｒｇＰｈｅＣｙｓＣｙｓＧｌｙＣｙｓＰｒｏＡｓｎＭｅｔＡｒｇＧｌｙＣｙｓＧｌｙＶａｌＣｙｓＣｙｓＡｒｇＰｈｅＳｅｒＳｅｒ＊＊＊。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王克坚，杨明，蔡晶晶，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[]