生产腺病毒载体的手段和方法技术

本发明专利技术涉及在互补细胞系上生产腺病毒载体的方法和手段，其中早期区域４可读框６（Ｅ４－ｏｒｆ６）编码核酸存在于腺病毒载体中且其中Ｅ４－ｏｒｆ６基因产物与互补细胞提供的Ｅ１基因产物的一或多种产物相容，由此所述腺病毒载体可以由互补细胞有效产生。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及核酸输送载体及其应用，更特别的，本专利技术涉及重组腺病毒载体及其应用。
技术介绍
迄今为止已经鉴别了51种人腺病毒血清型，基于血细胞凝集性质及序列同源性将它们再分为6个亚群(A、B、C、D、E和F)(Franckiet al.1991)。腺病毒感染周期分为早期和晚期阶段。在早期阶段中，所述病毒未包被而且基因组被转运至核中，之后所述早期基因区(E1、E2、E3和E4)成为转录活性的。所述E1区含有两个转录区E1A和E1B。E1A编码参与修饰宿主细胞周期及激活其它病毒转录区的蛋白质(参见Russell.2000所述)。E1B区编码两个主要蛋白E1B-19K和E1B-55K，其防止由于E1A蛋白的活性所诱导的凋亡(Rao et al.1992；Yew and Berk 1992；Shenk 1996)。另外，针对选择性病毒mRNA转运及宿主蛋白表达的抑制，在晚期阶段需要E1B-55K蛋白(Pilder et al.1986)。E2也被分为两个亚结构域E2A和E2B，其一起编码参与病毒基因组复制的三种蛋白质(一种DNA结合蛋白、一种病毒聚合酶及一种终端前蛋白)(Van der Vliet 1995)。E3对于体外复制是非必需的，但其编码破坏宿主对病毒感染的防御机制的一些蛋白质(Horwitz2001)。E4携带至少6个可读框(orf)，其编码参与病毒mRNA剪接和转运、宿主细胞mRNA转运、病毒及细胞转录及转化相关的一些独特功能的蛋白质(参见Leppard 1997)。形成病毒壳体及包装病毒基因组所需的晚期蛋白均产生自主要晚期转录单位(MLTU)，其在复制开始后变为完全活性的。差别剪接及聚腺苷酸化的复杂过程产生15个以上的mRNA物种，其共有一个三联前导序列。E1B-55K、E4-orf3和E4-orf6蛋白在调节晚期病毒mRNA加工中起关键作用并从核中转运。就此过程而言，E1B-55K与E4-orf6相互作用形成一种功能性复合物，其刺激病毒mRNA转运至细胞质，同时该复合物还参与抑制细胞mRNA从细胞核转运至细胞质(参见Leppard 1997和1998)。基于亚群C血清型Ad5或Ad2生产E1缺失的载体在E1互补细胞系(complementing cell lines)中实现，所述细胞系如293(Graham etal.1970)、911(Fallaux et al.1996)和PER.C6TM(Fallaux et al.1998；ECACC保藏号96022940)。正如WO 99/55132和WO 01/05945所揭示，载体和细胞系可以是匹配的以避免所述细胞系中的腺病毒序列与载体之间通过同源重组而产生可复制腺病毒。为有效生产衍生自C群的不可复制的腺病毒，优选使用细胞系PER.C6TM。使用这种细胞系可以匹配腺病毒载体，从而可以在没有可复制腺病毒的情况下生产C群腺病毒载体(Fallaux et al.1998；US专利No.6,033,908)。然而C群载体直接在体内应用时不总是理想的载体，因为感染效力受到在大多数人体中存在的高滴度的中和活性及特异性初级靶细胞(例如内皮细胞、平滑肌细胞、滑膜细胞(synoviocytes)、单核细胞及树枝状细胞)上没有足够量的细胞受体(柯萨奇(Coxsackie)-腺病毒受体，CAR)的严重影响。给予较高量的病毒以提高转导可以导致由于受处理的对象的中和滴度变化所致的毒性增加及不可预知的临床后果。这些限制通过使用其它血清型腺病毒可以克服。例如，当亚群B病毒(特别是血清型16)的尾丝的受体结合部分在基于Ad5的载体上表达时，引起人内皮细胞和平滑肌细胞(WO 00/31285)及人滑膜细胞(WO00/52186)的感染显著提高。另一亚群B腺病毒Ad35的尾丝在介导人单核细胞和树枝状细胞的感染中最有效(WO 00/03029)。另外，已经鉴别Ad35是一种病毒，大多数人群对其无中和活性(WO 00/70071)。通常感觉现有
需要揭示具有更广泛血清型用途的技术。一个特别的问题是缺乏这些其它血清型的合适的包装细胞系。Ad5载体的包装细胞系典型包含衍生自腺病毒血清型5的E1编码的蛋白质。这种‘标准’的包装细胞系例如是293,911和PER.C6TM。在这些标准包装细胞系上生产衍生自其它血清型的载体的尝试如果不是成功就是非常费劲的。偶尔，依赖于所使用的特殊血清型见到一些产品。然而，在Ad5的E1转化及无限增殖化的细胞系上生产的、衍生自除了亚群C之外的腺病毒亚群的重组腺病毒载体的产量很少。在Abrahamsen等(1997)的论文中，在包含衍生自腺病毒血清型5的E4-orf6的293细胞上观测到E1A缺失的腺病毒血清型7载体(亚群B)与没有来自Ad5的E4-orf6序列的293细胞相比改进的噬斑纯化。然而，遇到与载体稳定性相关的一个问题，及在噬斑纯化的原液(stock)中观测到意外的重组。遇到的另一个问题是在生产期间野生型腺病毒污染。另外，就大规模生产腺病毒而言，共转染E4-orf6以获得足够应用的高滴度是无效的。一个生长这种腺病毒的选项是提供具有稳定整合进互补/包装细胞系基因组中的E4-orf6基因的细胞。这种细胞在本领域已经加以描述(例如WO 96/22378所述)。这个系统的一个缺点是必须产生新的稳定细胞系，而且在产生稳定及正确的细胞之前必须进行大量选择循环。这个过程费力又费时。通常地，已经证明在Ad5互补细胞上从除了血清型5(亚群C)之外的血清型如亚群B病毒中产生并增殖腺病毒比较困难。正如WO 00/70071所揭示的，基于亚群B病毒Ad35的重组病毒可以通过共转染含有Ad35早期区域-1序列(Ad35-E1)的表达构建体而产生。另外，仅缺失E1A序列但未缺失E1B序列的基于Ad35的病毒示出在PER.C6细胞上有效复制，提示Ad5的E1A蛋白能互补Ad35-E1A的功能(见国际申请PCT/NL01/00824所述，还未公布)。另外，该实验示出缺乏Ad35-E1B导致在Ad5互补细胞上产量较低。WO 00/70071还揭示了生产E1缺失的非C群腺病毒载体的细胞系，通过进一步修饰能互补腺病毒血清型5的细胞系进行。WO 00/70071进一步提示应建立携带Ad35-E1序列以互补缺乏E1区域的重组腺病毒血清型35载体的新细胞系(也见于国际申请PCT/NL01/00824所述)。然而，正如以上所揭示的，如果针对特异性需要而应用特异性血清型，则应针对每种特异性血清型建立一种新的细胞系，或者应修饰可互补腺病毒血清型5的可获得细胞系以互补感兴趣的血清型。使用本领域可获得的确立细胞系无疑是有利的，应用本领域已确定的有效方法，将这些细胞系不用修饰地用于生产除了Ad5血清型之外的所有其它血清型。可以推断直至本专利技术为止，本领域还未获得可以有效生产与亚群C血清型不同的腺病毒血清型的灵活而适当的生产平台(production platform)。附图简述附图说明图1是质粒pΔMT.Orf6.Hygro(ECACC保藏号P02041226)的示意图。为明显起见，大写字母D代表δ(Δ)。图2是质粒pAd35.ΔMT.Orf6的示意图。为明显起见，大写字母D代表δ(Δ)。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒载体，其包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件，其中所述载体还包含编码功能性Ｅ４－ｏｒｆ６蛋白或其功能性部分、衍生物和／或类似物的一个序列，其中所述序列选自如下一组：１）衍生自与所述第一种血清型不同的第二种血清型 腺病毒的Ｅ４－ｏｒｆ６编码序列；２）包含一或多个密码子的缺失、突变、添加和／或取代的衍生自所述第一种血清型腺病毒的Ｅ４－ｏｒｆ６编码序列；和３）包含一融合体的Ｅ４－ｏｒｆ６编码序列，所述融合体是衍生自与所述第一种血清型不同的 第二种血清型的Ｅ４－ｏｒｆ６编码序列的一部分与衍生自第三种血清型的Ｅ４－ｏｒｆ６编码序列的一部分的融合体，其中所述第三种血清型与所述第一种血清型可以相同或不同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗纳德福格尔斯，亚伯拉罕布特，
申请(专利权)人：克鲁塞尔荷兰公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]