编码核酶的副粘病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供编码有活性核酶的副粘病毒载体。本发明专利技术的载体适于作为在广泛多种组织中进行目的核酶的体内或回体表达的基因治疗载体。可以将本发明专利技术的载体用于癌症和其它疾病的基因治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及编码具有催化活性的RNA的副粘病毒载体及其应用。
技术介绍
有催化活性的低分子量RNAs，例如核酶，已经被用于抑制真核细胞基因表达，而且最近它们在人类基因治疗中的应用引起关注。锤头型核酶主要在细胞质中激活，因此向细胞质的有效转运是成功的关键(Koseki，S.et al.，J Virol 73(3)，1868-77(1999)；Kuwabara，T.et al.，Proc Natl Acad Sci USA96(5)，1886-91(1999))。但是，大多数现有的载体在细胞核中引起基因表达，因此表达的核酶的出核效率是很大障碍。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供编码具有催化活性的RNA的副粘病毒载体及其应用。副粘病毒在其转录和复制过程中没有DNA阶段，并且它们的基因表达发生在细胞质。因此，本专利技术者考虑副粘病毒可能是潜在的适合核酶表达的载体。但是，副粘病毒载体在过去没有被用于表达核酶，并且不清楚有活性的核酶是否可以在细胞内被转录并有功能。因此，为开发能表达有活性的核酶的副粘病毒载体，本专利技术者将编码核酶的基因插入仙台病毒(SeV)载体中，将该载体感染细胞，并评价效果。已知K-ras的突变频率在结直肠癌中很高，将其选作靶点。Ras蛋白是参与细胞内信号转导的G蛋白之一，用缬氨酸取代12位的氨基酸导致细胞癌变。以前已经报道许多实验使用核酶靶向含有氨基酸12突变的区域(Funato，T.et al.，Cancer Gene Ther 7(3)，495-500(2000)；Tsuchida，T.et al.，Cancer Gene Ther 7(3)，373-83(2000)；Tsuchida，T.et al.，Biochem Biophys Res Commun 253(2)，368-73(1998)；Zhang，Y.A.et al.，Gene Ther 7(23)，2041-50(2000))。在本专利技术中，除了以前报道的K-ras核酶外，设计了带有不同长度K-ras识别位点的核酶并观察了它们的作用。发现通过感染编码核酶的副粘病毒载体，细胞中K-ras的表达可以被明显抑制。此外，与短的核酶相比，当核酶的长度为50个核苷酸或更长时，可明显改善从该载体表达的核酶的活性。当核酶的长度为60个核苷酸或更长时，用该载体导入的核酶的活性得到进一步改善，当长度为70个核苷酸或更长时，活性更高。因此，本专利技术首次利用副粘病毒载体成功地表达有活性的核酶，并证明，可以通过调节副粘病毒载体携带的核酶长度，改善从该载体表达的核酶的活性。副粘病毒感染发生在广泛的组织中。因此，使用编码核酶的副粘病毒载体，使得有可能直接在用传统载体很难导入基因的那些组织和细胞中进行核酶基因治疗。例如，通过使用本专利技术编码核酶的副粘病毒载体抑制癌基因等的表达，可以对各种癌症进行基因治疗。因此，表达核酶的副粘病毒载体可应用于各种临床病例。本专利技术涉及编码核酶的副粘病毒载体及其应用。更详细地，本专利技术涉及权利要求书中提出的每一专利技术。本专利技术也涉及权利要求所述一或多项(或全部)专利技术的所需组合，尤其是，本专利技术涉及引用相同独立权利要求的从属权利要求(涉及其它权利要求所述专利技术未能涵盖的专利技术的权利要求)所述一或多项(或全部)专利技术的所需组合。每个独立权利要求所述专利技术也打算包括从属权利要求所述专利技术的任何组合。具体地，本专利技术包括(1)编码具有催化活性的RNA的副粘病毒载体；(2)(1)的副粘病毒载体，其中RNA的长度是50个核苷酸或更长；(3)(1)的副粘病毒载体，其中RNA的长度是60个核苷酸或更长；(4)(1)-(3)的副粘病毒载体，其中RNA是锤头型核酶；(5)(1)-(4)的副粘病毒载体，其中副粘病毒是仙台病毒。在本专利技术中，重组的病毒意思是经重组的多核苷酸产生的病毒。重组的多核苷酸是其结合已经被人工修饰(切割或连接)的多核苷酸。重组的多核苷酸不以天然方式结合。重组的多核苷酸可以通过本领域已知的基因重组的方法产生，其中基因重组通过联合使用多核苷酸合成，核酸酶处理，连接酶处理，等等进行。重组蛋白可以通过表达编码该蛋白的重组多核苷酸来产生。重组病毒的产生可以是，表达经基因操作构建的编码病毒基因组的多核苷酸，然后重新组成病毒。“重组蛋白”包括经重组多核苷酸产生的蛋白，和人工合成的蛋白。本专利技术中，“基因”指一种遗传物质，一种编码转录单位的核酸。基因可以是RNAs或DNAs。在本专利技术中，将编码蛋白的核酸称作该蛋白的基因。此外，编码核酶的核酸称作核酶的基因。基因可以是天然产生的或人工设计的序列。而且，在本专利技术中，“DNA”既包括单链的也包括双链的DNAs。此外，“编码蛋白或核酶”意思是包括核酸或核酶的多核苷酸，其编码该蛋白的氨基酸序列或者核酶的正义或反义链，从而可以在适当条件下表达该蛋白。副粘病毒的基因在病毒基因组中以反义序列编码。本专利技术的副粘病毒载体实际编码有催化活性的RNAs(核酶)。具体地，本专利技术的副粘病毒载体在其病毒基因组中3’-前导序列和5’-尾随序列之间携带反义核酶RNA序列。在本专利技术中，副粘病毒指属于副粘病毒科的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一组基因组不分节段的负链RNA病毒，它们包括副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属(也称作副粘病毒属)，腮腺炎病毒属，和麻疹病毒属)，和肺病毒亚科(包括肺炎病毒和间质肺病毒)。应用于本专利技术的副粘病毒的具体例子是仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS病毒)，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3。本专利技术的病毒优选属于副粘病毒亚科的那些或其衍生物，更优选属于呼吸道病毒的种或其衍生物。可应用于本专利技术的呼吸道病毒种的病毒例子是人类副流感病毒-1(HPIV-1)，人类副流感病毒-3(HPIV-3)，牛副流感病毒-3(BPIV-3)，仙台病毒(也称作鼠副流感病毒-1)，和猴副流感病毒-10(SPIV-10)。本专利技术中最优选的副粘病毒是仙台病毒。这些病毒可以源自天然株，野生株，突变株，实验室传代株，人工构建株，等等。本专利技术中，“载体”是向细胞导入核酸的载体。副粘病毒载体是向细胞内导入核酸的源自副粘病毒的载体。副粘病毒例如上面描述的SeV是极好的基因转移载体。由于副粘病毒只在宿主细胞的细胞质中完成转录和复制，并且它们没有DNA阶段，所以不发生染色体整合。因此，它们不会由于染色体异常(例如癌化或永生化)而引起安全问题。当使用副粘病毒作载体时该病毒的这一特点对其安全性起很大贡献。当用于外源基因表达时，甚至在连续多次传代后，SeV几乎没有任何核苷酸突变，表明其基因组的高度稳定性和插入的外源基因d长期稳定表达(Yu，D.et al.，Genes Cells 2，457-466(1997))。SeV具有进一步的性质上的优点，例如对插入基因大小和对其包装的适应性，因为它没有衣壳结构蛋白。可复制的SeV载体可以导入大小至少4kb的基因，并且通过添加转录单位可同时表达2或3种基因。因此，可以从同一载体表达两种或更多的核酶。已知SeV对啮齿动物是致病的，引起肺炎，然而，它对人类是不致病的。这有以前的报道支持，其通过向非人类的灵长类鼻腔给予野生型SeV未表现出严重的不良效果(Hurwitz，J.L.et 本文档来自技高网...

【技术保护点】
副粘病毒载体，其编码具有催化活性的ＲＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：德炭刚，伴浩志，饭田章博，长谷川护，
申请(专利权)人：株式会社载体研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]