本发明专利技术涉及一种半抗原抗体的制备方法，具体来说，是用动物自体蛋白偶联半抗原制得完全抗原，然后用该完全抗原免疫动物来制备抗体。使用上述方法制备抗体的过程中不会引入外来的蛋白，机体所产生的抗体都是针对小分子化合物和小肽半抗原的，而针对自身的蛋白不会产生抗体。因此采用自体蛋白作为载体蛋白，所制备的半抗原抗体效价更高，特异性更好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种半抗原抗体的制备方法，特别是动物自体蛋白作为载体蛋白 用于半抗原抗体的制备方法。
技术介绍
半抗原是具有与抗体结合能力但是不能刺激机体产生抗体的分子。抗原是具 有异源性、结构复杂性和一定分子量大分子的三个必要元素组成，而半抗原虽具 有异源性和结构复杂性，但因为分子量不够大，在体内单独不足以被免疫细胞识 别和提呈所以不能激活淋巴细胞，产生抗体，但可以被已经生成的抗体所识别， 即具有免疫反应性但没有免疫原性。要想制备小分子半抗原抗体，第一步就是要 让低分子量的小分子半抗原变大分子，之后再按照完全抗原的方法制备抗体。小 分子变大分子一般有二种方法， 一是将小分子自身互相交联成同类分子聚体，二 是将小分子与大分子偶联。第一种方法不引入新的化合物，不会带入新的抗原结 构，但有时不容易化学交联，而完全抗原最低分子量要求也要数千到一万，小分 子要经过多次聚体化才能达到要求，也有可能使表位基团在反复聚合中被改变和 屏蔽。第二种方法使用大分子量蛋白作为载体，将小分子半抗原偶联到蛋白分子 表面组成完全抗原。这种交联方法比较简单，不足之处在于引入新的蛋白结构， 出现不需要的抗原表位，产生大量不需要的抗体。通常载体蛋白使用牛血清白蛋白(bovie serum albumiu BSA)、卵清蛋白 (ovalbumin 0V)、钥孔嘁血兰素蛋白(Hemocyanin KLH)和牛、马、羊Y球蛋 白等。这些蛋白的特点是分子量比较大，商品化样品容易得到，所以被广泛使用。 但同时因为上述蛋白对于免疫宿主而言通常不是自身蛋白，加之较大的分子量， 其本身就是一个完全抗原引起抗体产生，而载体蛋白上的抗原表位远远超过半抗 原的表位数量，被免疫动物对载体蛋白产生的抗体比主要针对半抗原本身的还要 多。这样对特定需要抗体的效价和特异性造成很不利的影响
技术实现思路
为了解决上述问题，我们提出采用动物自体蛋白用作免疫载体蛋白的技术克 服以上通用方法所产生的这种弊端。因为同一个体动物蛋白注入自身体内，没有 免疫原性，机体只对载体蛋白上的半抗原产生免疫反应，从而产生抗特定半抗原 的抗体。用于特异性抗血清制备的动物， 一般选用体量较大的动物，以便一次免 疫获得足量的抗血清，如大鼠、家兔、山羊、绵羊等，这些种类的动物体重一般 从300克到30千克不等，尽管体重差异较大，但都具备可以一次抽取2-20毫升 血液而不影响动物健康的条件。利用抽取的2-20毫升血液，可以分别纯化得到 10-100毫克y球蛋白或10-100毫克血清白蛋白，这样数量的蛋白足够作为半抗 原载体蛋白的所需剂量，用于随后的同一个体动物的免疫。主要
技术实现思路
如下一种半抗原抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤首先，采用动物自体蛋白作为载体蛋白与半抗原产生偶联反应得偶联完全抗原，然后用偶联完全 抗原免疫动物制得半抗原抗体。所述载体蛋白是取自被用于免疫动物的自体蛋白。所述自体蛋白是血清中的高丰度蛋白，具体的可以是白蛋白或Y球蛋白。所述制备方法是多克隆抗体的制备，也可以用于单克隆抗体的制备，免疫动 物包括小鼠、大鼠和家兔。目前制备多克隆抗体(抗血清)绝大多数是选择免疫家兔，从家兔血清制备 血清白蛋白，方法同样可以采用的利凡诺络合提取法，但也可以用硫酸铵沉淀法分歩获得Y球蛋白(40%饱和硫酸铵再加蛋白A亲和层析)和血清白蛋白(40% 饱和硫酸铵)。附图说明图1是实施例1的BSA电泳图，其中l:自制兔血清白蛋白2:商品化兔血清白蛋白(sigma纯度〉99%); 图2是FK506的结构式；图3是FK506与不同载体蛋白偶联后抗血清效价的测定结果； 图4是BNP与不同载体蛋白偶联后抗血清效价的测定结果。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。本实施例中采用利凡诺法纯化获得兔血清白蛋白。具体步骤如下1) 家兔耳缘静脉取血10ml， 4"下过夜放置；2) 4000 rpm/分钟，4。C下离心15分钟，取上清为兔血清，体积为4. 5毫升；3) 兔血清加用50 y。(NH4)2S(V沉淀，将沉淀去除后，以lmol/L盐酸调节pH值 为4.3-4.4，放置一小时后，用帆布自然过滤，刮去沉淀物；4) 将沉淀物包于玻璃纸透析带中，留取适当容积驱除空气，扎口，对流水进 行透析，直至硫酸铵含量低于2g/L时为止，得透析液；5) 合并透析液，量取体积，加入氯化纳搅拌溶解，质量浓度达8.5g/1，用帆 布自然过滤，取滤液测定蛋白质含量，再加入无热原水稀释蛋白质的质量 浓度至12-20g/l。加固体辛酸钠使蛋白质的质量浓度达2g/l，以lmol/1 盐酸调节pH值到5-5.2,搅拌溶解后，0-5'C下放置过夜。次日重调pH值 到5-5. 2，置水浴中加热至67。C时，加入2g/1 (0. 2%)活性碳，搅拌15min 升温到69'C，保温lh，然后冷却至45'C以下，用帆布自然过滤，取滤液；6) 调整蛋白质的质量浓度到100mg/ml，过滤除菌，凝胶电泳法鉴定其纯度〉 95%,见图1所示；7) -2CTC液体保存。实施例1 FK506多克隆抗体的制备FK506属大环内酯类抗生素，由一个半酮基，a、 e双酮基及23个环组成， 其分子式为C44He9N012 H20，分子量为822。其结构式如图2。它单独不能作为抗 原免疫动物获得特异性抗体，需要与一个载体蛋白偶联获得免疫原性。我们采用 酸酐法获得FK506的衍生物，然后用EDC法与自体血清白蛋白偶联。具体步骤如下1) 20mg的FK506用5ml吡啶溶解，加入50 mg戊二酸酐，80。C回流反应4 小时，并用硅胶薄层层析法检测反应进行程度，至接近完全反应时停止 回流反应；2) 减压蒸馏除去溶剂吡啶，得到FK506戊二酸单酯；3) 将10mgFK506戊二酸单酯用0.5mlDMF (二甲基甲酰胺)溶解；20 mg自 制兔血清白蛋白用2ml 0.05M的PBS (pH 7.2)溶解。 4) 2ml含20 rag自制兔血清白蛋白的溶液中加入50mg EDC (碳二亚胺)充 分混匀反应10分钟，将0. 5ml FK506戊二酸单酯溶液缓慢滴加入白蛋白 溶液中，反应30分钟，再加入50mg EDC 4'C反应过夜。5) 上述反应液用0. 05M的PBS (pH 7. 2)充分透析24小时。电泳法检测标记 效果。采用同样的方法偶联FK506同牛血清白蛋白，作为免疫用。 采用同样的方法偶联FK506同KLH，作为检测用。 3免疫后抗体滴度测定采用常规方法免疫动物，免疫分两组，每组免疫三只兔子。 兔血清白蛋白组采用自体白蛋白与FK506偶联的抗原去免疫动物(分别为 RSA-lft， RSA-2tt及RSA-3ft)。牛血清白蛋白组采用牛血清白蛋白与FK506偶联的抗原去免疫动物(分别 为BSA-1#， BSA-2ft及BSA-3ft)。三次免疫后，每只兔子耳缘静脉取血5ml，直接ELISA法测抗血清效价，方 法如下1) 包被用pH 9.6、 0.05M CBS (碳酸盐缓冲液)稀释FK506-KLH到2Pg/ml， 每孔100)4， 4'C过夜包被；2) 用5。/。PBST脱脂奶粉，37'C下封闭一小时；3) 抗血清稀释，两组血清都从l: 1000开始，用5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种半抗原抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，采用动物自体蛋白作为载体蛋白与半抗原产生偶联反应得偶联完全抗原，然后用偶联完全抗原免疫动物制得半抗原抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨子义，司徒维娜，高景燕，徐骥，贾世香，
申请(专利权)人：上海富纯中南生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[]
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