用于诊断RA的多联抗原膜片法检测试剂盒及其制作方法技术

本发明专利技术涉及一种用于诊断ＲＡ的多联抗原膜片法检测试剂盒，其包括载片和反应槽，载片载在反应槽上；载片的缺口与反应槽的缺口相对应；载片上设有多个人份反应区，与反应槽中的多个凹槽对应，每个凹槽上方都设有缺口；每个反应区都贴有膜条试纸，膜条试纸上印有ＲＡ相关抗原与反应质控带；ＲＡ相关抗原为ＲＦ、抗ＣＣＰ、抗ＲＡ－３３抗体、抗Ｓａ抗体、抗Ｐ６８所对应的抗原或抗原表位多肽中的四种以上抗原或抗原表位多肽，反应质控带指人ＩｇＧ和人ＩｇＭ的混合物。本发明专利技术的试剂盒克服了单一自身抗体检测灵敏度和特异度不足和数种自身抗体逐一单个检测在操作上的繁琐，提高了ＲＡ诊断的准确性和方便性。本发明专利技术还公开了上述试剂盒的制作方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种类风湿性关节炎(RA)多联抗原膜片法检测试剂盒及其制备工艺，更具体地说涉及将与类风湿性关节炎相关的多个抗原制作在检测试剂盒上，用来检测人体血清中是否含有与类风湿性关节炎相关的自身抗体。
技术介绍
类风湿性关节炎(以下简称RA)是一种最常见的以慢性多关节炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病，病程长，易反复，给患者造成很大痛苦。该病在我国的发病率约为0.36％，患者发病年龄多在20-50岁，女性多于男性，男女之比为1∶3。其突出的早期临床表现为对称性多关节红肿热痛，常见四肢小关节、指间近端关节肿胀，掌指(跖趾)、腕、肘、踝甚至颞颌等关节肿痛及活动困难；长久不愈的晚期症状，则有不同程度的关节畸形和强直，关节功能丧失等，可损伤脏器、多组织器官，造成股骨头缺血性坏死，对人体消耗大，致残率高。RA的诊断主要是依靠病人的临床症状(如3个以上关节且常呈现对称性关节炎，手部掌指腕关节多发性关节炎，关节晨僵和出现类风湿结节)、类风湿因子阳性及骨关节的影像学改变为诊断依据。到1987年，美国风湿病协会(ARA)修定的RA七项诊断标准中，将类风湿因子(以下简称RF)检测阳性作为一项重要的诊断标准，而且是唯一的一项实验室检查指标，并一直沿用至今。以临床表现作为诊断手段，一般要患者出现典型的病变体征和症状，疾病的病程一般已经到了中晚期，需要应诊医生有相应的临床经验，并且不同医生对同一个病例会有不同的诊断。实验室诊断因为具有客观性，对医生的临床经验的依赖性较小，甚至在临床症状出现之前就可以检测到特异性自身抗体，因此对RA的诊断，尤其是早期诊断，越来越依靠实验室血清学诊断。目前常用的实验室检测指标主要是RF，但RF特异性较差，不但在RA患者中出现，在其他结缔组织病及健康老年人中都可以检测到，这限制了它的诊断作用。近年来，陆续发现抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)以及含有APF和AKA相关抗体识别的表位的环瓜氨酸肽(CCP)、抗RA-33抗体、抗Sa抗体、抗P68抗体等自身抗体，对于RA的诊断都具有更高的特异性，而且有些抗体可在RA早期出现，因此可用于RA早期诊断。RA作为一种自身免疫性疾病，具有许多自身免疫性疾病的共性，即发病病因不甚明确，出现多种抗自身成分的自身抗体，同一病种不同个体临床表现不同，免疫功能异常的指标差异性较大的特点。体现在实验室检测上，表现为同一个检测指标部分患者阳性而部分患者阴性，甚至在部分正常人中也出现阳性；同一个患者某几种自身抗体阳性而其他自身抗体阴性，甚至一段时间阳性而行另一段病程自行转为阴性，所以会出现各种检测指标的不同灵敏度和特异性。自身抗体RF是风湿性关节炎最常见的自身抗体，在RA患者中阳性率约80％，但是在干燥综合症、混合结缔组织病和一些感染性疾病中也呈现阳性，因此特异性不是很高，约80％左右。APF和AKA特异性都很高，接近95％但灵敏性较差，在36％-80％之间，只有与之相关的抗CCP抗体在特异性和灵敏度上均比较满意。抗RA-33抗体、抗Sa抗体和抗P68抗体比较相似，阳性率在30％-50％之间，特异性大于90％。可以看出，任何一个单一检测指标对RA的诊断都有其局限性，而且在疾病的某一阶段或疾病的活动期与静止期各项指标还有所差异。
技术实现思路
针对现有技术的上述不足，本案专利技术人设计并制备完成了多联抗原免疫印迹膜片法，用一份病人血清和一次检测反应检测多种RA自身抗体，克服单一自身抗体检测灵敏度和特异度不足和数种自身抗体逐一单个检测在操作上的繁琐，以提高RA诊断的准确性和方便性。本专利技术所要解决的技术问题之一在于提供一种用于诊断RA的多联抗原膜片法检测试剂盒。本专利技术所要解决的技术问题之二在于提供上述用于诊断RA的多联抗原膜片法检测试剂盒的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供的用于诊断RA的多联抗原膜片法检测试剂盒，包括载片和反应槽，载片载在反应槽上；载片的缺口与反应槽的缺口相对应；载片上设有多个人份反应区，与反应槽中的多个凹槽对应，每个凹槽上方都设有缺口；每个反应区都贴有膜条试纸，膜条试纸上印有RA相关抗原与反应质控带；RA相关抗原为RF、抗CCP、抗RA-33抗体、抗Sa抗体、抗P68所对应的抗原或抗原表位多肽中的四种以上抗原，反应质控带指人IgG和人IgM的混合物。作为本专利技术的优选技术方案，上述载片优选以玻璃或塑料为支撑物，载片右上方的缺口与反应槽右上方的缺口相对应。作为本专利技术的另一优选技术方案，载片上最好有2-6个人份反应区，与反应槽中的2-6个凹槽对应，每个反应区最好贴有1-2个膜条试纸。作为本专利技术的再一优选技术方案，上述反应槽优选以塑料为材质，长度最好比载片略长，凹槽大小最好略比膜条大。使用本专利技术试剂盒检测时，在反应槽的凹槽上滴加已稀释的样本。然后将载片倒扣在凹槽里，反应即开始。如果样本中含有某一RA相关抗原的抗体，则膜条上所对应的抗原位置就会显色。每一次反应，膜条上的质控带都应显色，如果不显色，说明该次实验操作有误。另外，本专利技术还提供了用于诊断RA的多联抗原膜片法检测试剂盒的制作方法，其包含以下步骤1.载片的制作1.1裁膜按照免疫印迹点样器的大小，裁相应大小的膜，膜选自醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜和聚丙烯膜；1.2润湿把裁好的膜放在液体中浸湿；1.3配制各种与RA相关抗原的点样溶液和反应质控；1.4固定抗原将浸湿的膜条固定在免疫印迹点样器中，通过物理吸附和共价结合的方式，将配制好的反应质控和多种与RA相关的抗原以一定的排列次序固定在膜上；1.5封闭将膜放在无关蛋白或血清的溶液中对其非点样部位进行封闭，所述的无关蛋白或血清包括牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉、饱和赖氨酸和小牛血清；1.6干燥封闭后，把膜放于真空干燥箱进行烘干；1.7粘贴在于燥后的膜背后贴上双面不干胶，对膜进行裁剪，贴在载片上的反应区；1.8包装把粘贴好膜条的载片用铝箔袋包装；2.液体试剂配置2.1浓缩洗涤液的配制取适量的NaCL、Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O，溶解于水中，用NaOH调节PH值，再加入吐温-20，再加水混合至定量，灭菌，低温保存；2.2样本稀释缓冲液的配制将浓缩洗涤液稀释，称取BSA溶解其中，加入防腐剂和抗生素，再加水混合至定量，过滤，低温保存；2.3酶标记的抗人IgG抗体和抗人IgM抗体混合物的制备取酶标记的抗人IgG和人IgM抗体酶标结合物贮存液，分别加抗体稀释液稀释，两者按比例混匀，低温贮存；2.4酶底物的制备购买商品化的底物。相对于现有技术，本专利技术具有下述优越性1.多指标同时检测。本专利技术把与RA相关的多种抗原吸附在一个膜条上，用一份病人血清和一次检测反应即可检测多种与RA相关的自身抗体，克服单一自身抗体检测灵敏度和特异度不足和数种自身抗体逐一单个检测在操作上的繁琐，提高了RA诊断的准确性和方便性。2.多人份同时检测。试剂盒中一个载片上包含多个人份的膜条，因此可以同时检测多个人份。3.操作简单、安全。不仅效率高而且降低了成本，从而使诊断费用降低，实用性强。附图说明图1为本专利技术用于诊断RA的多联抗原膜片法检测试剂盒的载片结构示意图。图2为本专利技术用于诊断RA的多联抗原膜片法检测试剂盒的反应槽结构示意图。图3为本专利技术用于诊本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断ＲＡ的多联抗原膜片法检测试剂盒，其特征是，其包括载片和反应槽，载片载在反应槽上；载片的缺口与反应槽的缺口相对应；载片上设有多个人份反应区，与反应槽中的多个凹槽对应，每个凹槽上方都设有缺口；每个反应区都贴有膜条试纸，膜条试纸上印有ＲＡ相关抗原与反应质控带；ＲＡ相关抗原为ＲＦ、抗ＣＣＰ、抗ＲＡ－３３抗体、抗Ｓａ抗体、抗Ｐ６８所对应的抗原或抗原表位多肽中的四种以上抗原或抗原表位多肽，反应质控带指人ＩｇＧ和人ＩｇＭ的混合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨子义，倪健，魏国兰，丁妍，陈闻卓，
申请(专利权)人：上海富纯中南生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]