一种用ATP合成酶鉴定肿瘤前期和肿瘤状态的方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定肿瘤前期及／或肿瘤细胞的方法，该方法包括有下列步骤：ａ．用抗原免疫动物，获得目标抗体；ｂ．使用哺乳动物细胞、组织，制作细胞芯片和组织芯片；ｃ．利用免疫组化方法，使用步骤ａ制备的抗体检测ＡＴＰ合成酶在组织和细胞中的表达情况；以及，ｄ．确定哺乳动物细胞及／或组织的ＡＴＰ合成酶表达图，并通过判断标准对结果进行定性。该方法诊断精度高，可以将假阴性率降到非常低的水平，诊断判断可靠性高并且简单，不需要相当的经验，并可以对异质性的癌组织进行随机和可控制的检验，从而提高切片检查结果的可信度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，有关于鉴定哺乳动物肿瘤前期和肿瘤状态的方法，尤其有关于一种根据ATP合成酶的差异性表达鉴定细胞和组织肿瘤形成前期和肿瘤形成的方法。
技术介绍
在进行肿瘤诊断时，常用的组织学染色剂是H&E(苏木精和伊红)染色，它们可差异性标记亚细胞成分。其它诊断方法还有采用针对细胞/组织中(通过细胞内表位)或细胞/组织表面(通过细胞外表位)的特定诊断性分子的抗体，再通过显色反应使这些分子在显微镜下可见，以达到鉴别诊断的目的。三磷酸腺苷合成酶，即ATP合成酶(Adenosine Triphosphate Synthase)主要是F1F0型ATP合成酶，由F1和F0两个主要部分组成，F1在膜的外侧，由5个不同的亚基组成，用化学计量法表示为α3β3γδε，包含3个结合位点，在每一个β亚基上。F0形成一个跨膜蛋白，由3个不同的亚基组成，化学计量法表示为a1b2c10-12。这个大分子蛋白复合体利用电子梯度和相关的膜电势来合成ATP，也可以逆过程水解ATP来产生一个电子梯度(参见Pederson，P.L.，and L.M.Amzel.1993.《ATP synthases，Structure，reaction center，mechanism，andregulat ion of one of nature’s most unique machines》，《J.Biol.Chem.》，2689937.)。ATP合成酶主要存在于细菌的细胞膜、植物的叶绿体类囊膜和植物或动物的线粒体内膜上，在氧化磷酸化过程中催化ATP的合成。在人类内皮细胞的浆膜上也发现了F1F0型ATP合成酶。Das等研究发现ATP合成酶β亚单位表达于肿瘤细胞的细胞膜上，并且是淋巴细胞介导的细胞毒作用的配体，抗β亚单位处理将抑制NK细胞和LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(参见Das，B.，Mondragon，M.O.，Sadeghian，M.，Hatcher，V.B.& Norin，A.J.《A novel ligand inlymphocytemediated cytotoxicityexpression of the beta subunit of H.transportingATPsynthase on the surface of tumour cell lines》，《J.Exp.Med.》，180，273-281(1994))。越来越多的研究发现细胞膜上的ATP合成酶具有重要的功能，如血管内皮细胞胞膜上的ATP合成酶是抗血管因子(angiostatin)的受体(参见Moser，T.L.et al.《Angiostatinbinds ATPsynthase on the surface of human endothelial cells》，《Proc.Natl Acad.Sci.USA》，96，2811-2816(1999))，以及抗血管因子(angiostatin)与ATP合成酶结合而发挥其抗肿瘤作用(参见Moser，T.L.et al.《Endothelial cell surface F1-F0ATPsynthase is active in ATPsynthesis and is inhibited by angiostatin》，《Proc.NatlAcad.Sci.USA》，98，656-6661(2001))。前列腺癌在欧美发病率极高，在高龄男性中仅次于肺癌，但在我国比较少见，近年发病率在增加。在西方国家中，前列腺癌的发生率正以惊人的速率增长，过去五年中，其增长超过1倍。在所有肿瘤中，它的发生率仅次于全世界男性癌症死亡最常见病因的肺癌，是澳大利亚的第一位癌症死亡病因。尽管这种情况很严重，但诊断方法却很少，而且不够精确。目前评估预后的方法，例如超声波法、前列腺酸性磷酸酶水平法、雄激素剥夺法，前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)密度法、PSA速变法(参见Stamey，T.A.，N.Yang，A.R.Hay，J.E.McNeal，F.S.Freiha，and E.Redwine；1987，《Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of the prostate》《N.Engl.J.Med.》，317909-916.)、PSA年龄特异性参考范围法以及Gleason组织病理学分级法都不能对前列腺癌的临床结局提供可靠的预测信息。例如，研究显示直肠指检法的结果有36.9％假阴性率。前列腺特异性抗原是与前列腺外许多组织相关的一种33-kDa的丝氨酸蛋白酚，受雄激素、糖皮质激素和黄体酮的上调，据认为参与生长因子的调节。然而，血清前列腺特异性抗原水平的假阴性诊断率为23％，假阳性诊断率为36.7％，甚至有人提出超过半数的新筛检病例实际上为假阳性。试图通过引进其他的测试法，例如前列腺特异性抗原密度、速率以及年龄特异性参考范围来改进筛检方法结果也是不确定的。由于这种不确定性，常进行前列腺的活组织检查来证实恶性，但这种检测方法很不令人满意，存在23％的假阴性诊断率，原因是未能直接采到发生癌变部位的样品。治疗方法的选择在很大程度上取决于根据组织切片显微镜分析得出的临床阶段。这种技术依赖于对组织学表现与临床结局相关性的判断和相当的经验。然而，前列腺癌组织是异质性的，某些重要的诊断特征在切片检查时很容易被忽略。同时，目前尚没有检验外科手术或是放射治疗结果的随机并可控的试验。可选择的治疗方法基本上包括有前列腺切除术、放射治疗法、雄激素剥夺法和“观测性等待”。“观测性等待”对根治性干预问题的明确回答需等待前列腺癌干预对观察试验的结论。这些决定的结果对于病人而言往往非常严重，比如前列腺切除术法经常会导致小便失禁、膀胱颈狭窄、疼痛和消沉。对于其他诸如乳腺癌或结肠癌等癌症，采样可能由于若干原因而被错误诊断。全球每年120万妇女罹患乳腺癌，且有50万死于该病。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤首位。据1992-1996年统计，美国每10万人中就有110.6个人患有乳癌。而处于相低发区的中国，发病率更是呈逐年上升的趋势。乳腺肿瘤，定位肿瘤的边界可能不很明确(如果H&E染色判定)，组织学上明显癌瘤和正常组织之间的边界也是常常变化的，从而往往在肿瘤的周围切下或多或少的会影响检测的正常组织。通过本专利技术，ATP合成酶可以容易地通过免疫组织化学方法而观察到，并且已显示它们存在各种各样的表达模式，如细胞表面、线粒体和斑点标记。这些表达模式可以用于鉴定癌发展的不同阶段，从完全正常组织开始，发展至肿瘤前期、肿瘤期。因此，本专利技术为诊断癌症前期状态(如增生)至癌症阶段，以及为研究癌症发生的生理学和病因学提供了一种新方法。本专利技术所述的ATP合成酶及其抗体，可以制作成试剂盒，单独或联合其他指标来诊断肿瘤，也可以ATP合成酶为靶标，开发治疗性产品。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种鉴定肿瘤前期及/或肿瘤细胞的方法，该方法诊断精度高，可以将假阴性率降到非常低的水平。本专利技术的另一目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定哺乳动物肿瘤前期和肿瘤状态的方法，其特征是包括有下列步骤：ａ．用抗原免疫动物，获得目标抗体；ｂ．使用哺乳动物细胞、组织，制作细胞芯片和组织切片；ｃ．利用免疫组化方法，使用步骤ａ制备的抗体检测ＡＴＰ合成酶在组织 和细胞中的表达情况；以及，ｄ．确定哺乳动物细胞及／或组织的ＡＴＰ合成酶表达图，并通过判断标准对结果进行定性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：倪健，彭艳，杨子义，罗鹏，
申请(专利权)人：上海富纯中南生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]