一种产生Ｔ－２０融合蛋白的方法，该方法包括： （ａ）将编码Ｔ－２０与Ｆｃ的融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌、甲醇酵母、ＣＨＯ或昆虫表达载体，得到Ｔ－２０融合蛋白重组表达载体； （ｂ）将步骤（ａ）中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达Ｔ－２０融合蛋白的工程菌； （ｃ）在适合所述融合蛋白表达的条件下发酵培养步骤（ｂ）中的工程菌； （ｄ）从步骤（ｃ）的发酵培养产物中纯化分离出所述融合蛋白。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及T-20融合蛋白、其制备方法及用途。具体而言，本专利技术实现了T-20融合蛋白在甲醇酵母中的表达，并建立了蛋白质纯化的方法，使得大批量、低成本的生产成为可能，为T-20融合蛋白的临床应用打下了良好的基础。
技术介绍
HIV-1入侵宿主细胞有两个重要步骤受体识别和膜融合。HIV-1首先识别宿主细胞表面的特异受体蛋白并与之相结合，然后病毒和宿主细胞表面发生了复杂构象变化，导致HIV-1膜与宿主细胞质膜相融合，使得HIV-1核心颗粒进入宿主细胞的原生质中。与其他逆转录病毒类似，HIV-1的膜糖蛋白以多蛋白前体分子的形式在宿主细胞的粗面内质网上合成。编码膜糖蛋白前体的env基因位于病毒基因组的后半区，表达产物为一段88kD的多肽链。这一多肽链在合成过程中进入内质网腔并被糖基化，使分子量达到160kD，因而被称为gp160。gp160以单一跨膜肽段锚定在内质网膜上，并在合成后不久形成三聚体。在高尔基复合体中，gp160三聚体的糖基被修饰成更为复杂的形态，并且每个gp160分子均被宿主细胞的蛋白水解酶切断。形成分子量分别为120kD和41kD的两个成熟蛋白质，分别称为gp120和gp41，gp120包围在gp41三聚体表面，以非共价键相互结合形成gp120/gp41复合体。另外，gp120与gp41之间还可能形成二硫键，使复合结构更加稳固。成熟的gp120/gp41三聚体通过高尔基复合体分泌的大囊泡到达宿主细胞质膜，参与对HIV-1病毒颗粒的包裹。HIV-1入侵的第一步是gp120与细胞表面的CD4受体分子相结合。gp120与CD4的结合区域主要是C4区，C3区和C5区也参予了与CD4的结合。Smith等(Smith D H，Byrn R A，Marsters S A，et al.Science，1987；2381704)还发现可溶性CD4(sCD4)也能与gp120结合，使gp120从病毒膜上脱落下来，从而中和HIV-1的感染。但由于中和反应在大多数HIV-1株系中不能发生，因而sCD4不能作为一种治疗药物。HIV-1的细胞入侵还需要共受体的参与。很早就发现，HIV-1不能入侵整合了人CD4的小鼠细胞。但将人的CD4-细胞与小鼠CD4+细胞融合以后，HIV-1则能进入杂交细胞。另外，特定的HIV-1株只能感染某几类人CD4+细胞，但不能感染其他类型的人CD4+细胞。这些实验都说明HIV-1的入侵还需要人类细胞表面的其他具有组织特异性的辅助因子。共受体与gp120的相互作用非常复杂。一般认为，gp120在与CD4结合以后，经过构象变化而形成了共受体的结合位点。Atchison等(Atchison R E，Gosling J，Monteclaro F S，et al.Science，1996；2741924)的分析表明，HIV-1入侵需要gp120与共受体形成一种复杂的结构，而决不仅仅是简单的位点结合。这种结构一旦形成，就使gp120与gp41脱离，从而启动了HIV-1入侵宿主细胞的下一过程膜融合。HIV-1不仅能使其膜宿主细胞膜融合，而且能介导被感染细胞与周围的CD4+细胞发生融合，形成合胞体。直接参与病毒-细胞融合或合胞体形成的是gp41的膜外侧区域。该区域从N端起依次为融膜肽(fusion peptide)、螺旋段1(H1)、免疫环区(IM)、螺旋段2(H2)。1997年，在Cell和Nature杂志上分别发表了gp41膜外侧主要区域(H1和H2)晶体结构的X射线测定结果。在晶体结构中，三段H1螺旋平行排列于中央形成核心，三段H2螺旋反平行地围绕在周围，形成螺旋六元束。这证实gp41以三聚体存在。T-20取自病毒的膜蛋白gp41膜外区域C末端序列，共有36个氨基酸，它是艾滋病病毒的膜融合抑制剂。临床试验表明，单独或复合用药，对艾滋病都具有明显的治疗作用。491名来自北美和巴西的志愿者参加T-20的临床试验，在此以前，平均每人已经使用12种抗艾滋病药物，他们平均的病毒载量是100,000/μl，T细胞计数为80/μl。实验中，每人使用3到5种药物治疗。一组只使用上市的药物，一组使用上市药加T-20。6个月后，使用T-20的受试者中37％的病毒载量降到检测不到的水平(低于400/μl)，而对照组只有16％。使用T-20的受试者中20％的病毒载量降到低于50/μl，而对照组只有7％。T-20的受试者的T细胞平均增长了76/μl，而对照组只增长了32/μl。另有504名来自欧洲和澳大利亚的志愿者也参加了临床实验，在此以前，所有的受试者都曾经使用药物治疗，并且最后失败，他们平均的T细胞数为98/μl。6个月后，使用加入T-20治疗的受试者中28％的病毒降到检测不到的水平(低于400/μl)，而对照组只有14％。T-20的受试者的T细胞数平均增长了65/μl，而对照组只增长了38/μl。T-20抑制膜融合的机理还不是很清楚。根据gp41和流感病毒融合蛋白红细胞凝集素具有相似性，有人于1993年提出了“发夹前体中间体理论”，即HIV在发生膜融合时，H1螺旋卷曲结构从H2螺旋三员束中被拉出，而成为游离状态，T-20趁机结合于H1，阻止了以后发夹结构的形成和膜融合。但近期的研究发现，H1并不存在T-20的特异性结合位点，在H2区域也存在T-20结合区；同时，T-20还具有膜反应性，C末端辛基修饰的T-20可以更好的完成膜定位，表现出更高的抑制效应，因此T-20的抑制效应可能还和膜反应性有关。Fc指包括抗体的非抗原结合部分序列的分子或序列，优选人源，可以来自任何一种同工型，如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。Fc与T-20的融合蛋白相比T-20具有更高的稳定性，而且在体内的半衰期更长。而甲醇酵母表达体系是近几年发展起来的高效表达系统，相比于大肠杆菌、哺乳动物细胞以及昆虫细胞表达体系而言，甲醇酵母表达体系具有很好的表达可控制、可分泌表达、蛋白易于纯化、表达量高、成本较低等优点。我们将T-20和Fc基因同时克隆到一个表达载体中，转化甲醇酵母，筛选到了高表达菌株，然后摸索了发酵、纯化工艺，实现了T-20融合蛋白的大规模生产，为其临床应用奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供T-20与Fc的融合蛋白。本专利技术的另一个目的是提供用甲醇酵母表达T-20融合蛋白并分离纯化制备T-20融合蛋白的生产方法。该方法包括(a)将编码T-20与Fc的融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌、甲醇酵母、CHO或昆虫表达载体，得到T-20融合蛋白重组表达载体；(b)将步骤(a)中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达T-20融合蛋白的工程菌；(c)在适合所述融合蛋白表达的条件下发酵培养步骤(b)中的工程菌；(d)从步骤(c)的发酵培养产物中纯化分离出所述融合蛋白。该方法还包括，在所述步骤(a)之前，以化学合成获得的T-20基因为模板进行PCR，并以RT-PCR方法获得Fc基因。本专利技术的另一个目的是提供获得的T-20融合蛋白的药物制剂。本专利技术还提供了上述药物制剂用于预防和治疗艾滋病的用途。本专利技术中所述的T-20融合蛋白指T-20或其变体、片段与Fc或其变体、片段融合的蛋白。在一个优选实施例中，所述T-20融合蛋白为R1-L本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：倪健，罗鹏，杨武剑，郑颖，
申请(专利权)人：上海富纯中南生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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