一种产生ＣＣ１０蛋白的方法，该方法包括： （ａ）将编码ＣＣ１０蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌或酵母表达载体，得到ＣＣ１０蛋白重组表达载体； （ｂ）将步骤（ａ）中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达ＣＣ１０蛋白的工程菌； （ｃ）在适合ＣＣ１０蛋白表达的条件下发酵培养步骤（ｂ）中的工程菌； （ｄ）从步骤（ｃ）的发酵培养产物中纯化分离出所述ＣＣ１０蛋白。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及CC10蛋白的表达和制备方法，及其在治疗哺乳动物肺部相关疾病、哮喘、肿瘤以及肾脏疾病等方面的应用。
技术介绍
CC10(Clara cell 10kDa protein，Clara细胞10kDa蛋白)，又称为UGB(Uteroglobin，子宫球蛋白)、CCSP、CC16，主要由肺泡II型Clara细胞分泌，分基本型和类固醇诱导型两类，是分泌球蛋白家族(secretoglobins，SCGBs)成员。和其他家族成员类似，CC10通过链间的二硫键形成二聚体，蛋白中主要是α螺旋结构。人CC10基因位于11号染色体q12.3-q13.1区，全长4.1kb，含有3个外显子，2个内含子。CC10蛋白前体共91个氨基酸，其中21个为信号肽，成熟蛋白70个氨基酸。其中3位的半胱氨酸与另一蛋白的69位形成二硫键，同时69位半胱氨酸与对应蛋白的3位形成二硫键，从而形成了由两个链间二硫键相连的二聚体。形成的二聚体比较稳定，对酸、酶都有很好的耐受性。CC10蛋白是良好的谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase，TG)的天然蛋白底物，体外试验中，TG能催化CC10蛋白通过相互交联形成高分子的聚合物。CC10具有免疫调节、抗炎、抗纤维化和抗肿瘤等生物学活性。体外研究表明，CC10是分泌型磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)的强抑制剂(Am.J.Respir.Crit.Care Med.152290)，而PLA2与炎性介质的产生密切相关，PLA2可溶解肺泡表面卵磷脂，是感染性疾病诱发ARDS的关键因素；CC10还可抑制细胞释放花生四烯酸，花生四烯酸经脂氧化酶及环氧化酶作用，生成白三烯、血栓素、前列腺素等炎性介质，介导炎性细胞的趋化、激活以及细胞外基质浸润。CC10可以抑制甲酸蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(Formyl methionine-leucine-phenylalanine，FMLP)诱导的中性粒细胞和单核细胞的趋化作用(Cell Mol.LifeSci.55771)；CC10还抑制在体外IL-2刺激的人外周血淋巴细胞释放TNF-α、IL-1β以及IL-8等炎性细胞因子(J.of Immunology 2001，1673025)；CC10还能够结合细菌的细胞膜，从而抑制毒素在肺部积累，减轻肺部损伤；疏缓肺部平滑肌和肺部血管，改善肺功能。研究表明，CC10基因缺陷小鼠对多种损伤因素均敏感，如100％浓度的氧吸入、臭氧吸入、病毒或细菌感染等，并且更容易演变成急性呼吸窘迫综合症样的肺泡改变；进一步研究表明，当CC10基因缺陷小鼠气管内感染腺病毒或假单胞杆菌时，局部的中性粒细胞明显增加，在肺脏匀浆中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平表达也增高(Am.J.Respir.Cell Biol.17147)。一些间接性的证据也提示CC10是肺脏炎症的重要保护性机制，如肺部出现炎症反应时，相应肺脏产生CC10增多；吸烟导致CC10的产生减少，血清中CC10含量相应降低；CC10基因定位于染色体11q13区，基因学研究表明该区与超敏和支气管超反应性相关，并且在哮喘患者中发现CC10不同的等位基因(Am.J.Respir.Crit.Care Med.160930)；在新生儿呼吸窘迫综合症和多种因素导致的急性呼吸窘迫综合症的情况下，局部或全身CC10水平异常。目前，CC10蛋白在临床上的应用已经取得了很大的进展，CC10已经被美国FDA批准用于治疗新生儿呼吸窘迫综合症(Neonatal respiratory distresssyndrome，nRDS)，这些新生儿不能产生天然CC10，容易发展成严重肺部感染。在支气管-肺发育不良症(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)上也已完成II期临床。在美国，CC10正在被尝试用于治疗成人呼吸窘迫综合症，其适应症范围还可扩大到特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺炎、哮喘等。此外，CC10在肾脏疾病及癌症治疗方面也有一定作用。天然CC10在保护肾脏功能方面至关重要。许多糖尿病及慢性高血压的患者逐渐丧失肾功能，最后需要透析或肾移植，实验室结果表明， 血液中的天然CC10可以抵制肾脏衰竭，重组CC10可能对肾脏疾病的减缓有一定作用。CC10通过TG交联到细胞膜上，从而保护了胚泡、精子等细胞上的抗原位点，防止引起不必要的免疫反应。在体外试验中(Proc.Natl.Acad.Sci.USA932915)，CC10能通过特异性受体，抑制人滋养层细胞和NIH 3T3细胞穿透人工基底膜，证明它在正常怀孕过程中防止绒膜癌的产生有重要作用。最新研究表明，CC10可以抑制肿瘤细胞的生长和代谢，有鉴于此，重组CC10可以和其他化疗药物联合使用，用于癌症治疗。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供用大肠杆菌或甲醇酵母表达CC10蛋白并分离纯化制备CC10蛋白的生产方法。本专利技术的另一个目的是提供含有所获得的CC10蛋白的药物制剂。本专利技术还提供上述CC10蛋白在制备预防和治疗哺乳动物肺部相关疾病、哮喘、肿瘤以及肾脏疾病的药物中的用途。本专利技术生产CC10蛋白的方法包括(a)将编码CC10蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌或酵母表达载体，得到CC10蛋白重组表达载体；(b)将步骤(a)中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达CC10蛋白的工程菌；(c)在适合CC10蛋白表达的条件下发酵培养步骤(b)中的工程菌；(d)从步骤(c)的发酵培养产物中纯化分离出所述CC10蛋白。通常，在进行上述步骤(a)之前，根据文献报道，按照大肠杆菌偏爱密码子设计CC10的基因片段，同时设计引物，并引入适当的内切酶位点，然后采用PCR方法将基因拼接全长，从而获得CC10蛋白的核苷酸序列。本专利技术所述的CC10蛋白包括其变体，所述变体有1-5个添加、缺失或置换。本专利技术CC10蛋白或其变体可选自(a)SEQ ID NO1所示的CC10蛋白序列；(b)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met的序列；(c)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met-Ala-Ala的序列。本专利技术所述的CC10蛋白还包括CC10蛋白本身与免疫球蛋白Fc或白蛋白融合产生的蛋白。众所周知，与免疫球蛋白或白蛋白融合可以延长蛋白的半衰期，从而提高蛋白的活性。本专利技术提供一种编码CC10蛋白的核酸序列。众所周知，一种氨基酸可以有多种密码子编码，本专利技术分别提供了一种编码CC10蛋白的核酸序列(SEQ IDNO2)，但在某些实施方案中，可以根据实际需要对核酸密码子进行突变，特别是选用宿主菌偏爱密码子，但所产生的CC10蛋白的氨基酸序列不变。本专利技术中所指的大肠杆菌可以是各种菌株如DH5α、BL21(DE3)、K802等，本专利技术宿主菌优选BL21(DE3)。而选用的表达载体可以是pBV220、pET11a、pET32a(+)等本领域已知的载体。本专利技术优选大肠杆菌pET表达载体，最佳为pET32a(+)。本专利技术中所指的甲醇酵母包括巴德氏毕赤酵母(pichia pastoris)、pichiamathonolica等能够利用甲醇作为唯一碳源的酵母。本专利技术中使用的表达载体可以选用各种已知的载体，如商业化的载体pHIL-D2、pPIC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：倪健，张婷婷，杨武剑，罗鹏，刘定燮，
申请(专利权)人：上海富纯中南生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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