一种钉螺呼吸蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种钉螺呼吸蛋白的制备方法。通过机械挤压、组织剥离、血淋巴提取、硫酸铵沉淀、超高速离心分离等手段，从日本血吸虫中间宿主——钉螺体内提取出了一种含铜离子的呼吸蛋白。该呼吸蛋白中含铜0.2-0.3％，其紫外特征吸收峰位于275nm、340nm处，在透射电子显微镜下可观察到圆柱形聚集体结构。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物、医药提取技术，涉及一种从钉螺中提取分离钉螺血蓝蛋白的方法，具体地说，是一种组织剥离与机械挤压、硫酸铵沉淀以及超高速离心三步法从钉螺中提取出高纯度钉螺血蓝蛋白的制备方法。
技术介绍
在漫长的进化过程中出现的执行输氧功能的呼吸蛋白大致有血红蛋白 (hemoglobin)、虫丘虫引血红蛋白(hemerythrin)和血蓝蛋白(hemocyanin)。无脊椎动物两大门-节肢动物和软体动物血淋巴中存在的是一种氧合时呈蓝色的呼吸蛋白-血蓝蛋白。血蓝蛋白是一种具有多亚基四级结构的巨大复杂分子，其氧合氨基酸残基位点处结合有一对铜离子，脱氧状态为一价，蛋白表现为无色；结合一分子的氧后转为二价，蛋白则呈蓝色。软体动物血蓝蛋白的亚单位很大，相对分子质量可达350-450KDa，每个亚单位由7_8个大小为50KDa的相似功能单位(FU)组成。钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主，为软体动物门钉螺属。研究发现其血淋巴中所含呼吸蛋白为钉螺血蓝蛋白。专利技术人对蛋白SDS-PAGE与基因克隆研究结果表明其符合一般软体动物血蓝蛋白基本特征，是一种较为典型的软体动物含铜呼吸蛋白。软体动物血蓝蛋白不仅起着输氧的基本功能，它还是一种具有酚氧化物酶活性的分子，具有很强的抗原性质，被认为是一种重要的免疫分子。从同属腹足软体壳类动物 Megathura crenulata 血淋巴中提取的钥戚孔血蓝蛋白(keyholelimhet haemdcyanin, KLH)与曼氏血吸虫、日本血吸虫之间存在共同的抗原表位，被广泛地应用于血吸虫病的诊断、抗炎抗病毒和肿瘤免疫治疗。1998年Taylor MG等研究了以KLH为载体的日本血吸虫病疫苗；2000年Wuhrer，M等证实KLH血蓝蛋白中含海藻糖的低聚糖是血吸虫与血蓝蛋白的共同抗原表位；2002Kantelhardt, S. R等进一步分析了海藻糖的低聚糖抗原表位的结构，确定了其结构为Fuc(a 1-3) GalNAc ;同年Kurokawa, T等报道发现了一新的共同抗原表位 Gal ( P 1-6)Man。血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的输氧胞外蛋白，其提取方法通常采取传统的用注射器从动物心脏或者足部抽取血淋巴，然后低速离心去除血细胞而获得粗品血蓝蛋白。如Karen I. Miller用凝胶过滤纯化章鱼(Octopusdofleini)血蓝蛋白，Pablo De Ioannes用硫酸铵沉淀法初步得到似鲍罗螺(Concholepas concholepas)血蓝蛋白，一些还用到超高速离心等技术进行血蓝蛋白的纯化。钉螺个体细小，心脏更是细微，难于采取注射器直接抽取的方式提取血淋巴；单一的硫酸铵沉淀与低速离心方法得到的血蓝蛋白也存在杂质过多的缺点；凝胶过滤纯化速度慢，只能小量制备等限制了较大量高纯度钉螺血蓝蛋白的提取与制备。本专利技术特点在于其适合从个体细小的钉螺体内提取分子量巨大的蛋白分子。准确截取钉螺含血淋巴部位作为提取血蓝蛋白之原料，机械挤压得到粗制钉螺血淋巴，同时利用结缔组织等固体不溶于缓冲溶液，低速离心即能分离的原理得到粗品钉螺血蓝蛋白。采取超高速离心又可以达到分离该分子量巨大的血蓝蛋白与其它杂质蛋白和可溶性成分的目的，从而制备得到高纯度的钉螺血蓝蛋白。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本专利技术的目的在于，提供一种从钉螺体内提取与制备钉螺血蓝蛋白的方法，采取组织剥离与机械挤压、硫酸铵沉淀和超高速离心三步法从钉螺组织中提取分离出钉螺血蓝蛋白。根据钉螺的心脏及一些主要血管处于其肌肉部位一侧，而其他的器官(大肠、小肠、胃、脾)在该动物的软体末端部位，我们通过在心脏处截断钉螺软体组织并收集位于连接处心脏一侧组织(图I)，利用机械挤压的方法使血淋巴从经断裂的血管处流出，即可方便的收集得到钉螺血淋巴液。所收集组织均为不溶性固态结缔组织可方便后续低速离心除去。钉螺血蓝蛋白纯度鉴定采用SDS-PAGE与HPLC进行；浓度测定为Bradford法。具体步骤如下I)机械截取与挤压批量钉螺置于两玻璃板间，对上层剥离加压破碎钉螺外壳得到壳内软体。利用解剖针依图I在钉螺中间心脏位置处截成前后两部分，取前部组织(主要包含钉螺头、足、腮和心脏)作为钉螺血淋巴提取原料，收集于含0. 01 0. IOM的TriS-HCl缓冲液(pH7. 0，内含5mM CaCl2, 5mM MgCl2)的容器中。机械挤压软体，使血淋巴由心脏经断裂血管处流出溶解于缓冲液，即可方便得到钉螺血淋巴液，低速离心弃去其它固体结缔组织。2)硫酸铵沉淀将溶解有钉螺血淋巴的缓冲液从试管转入离心管，将此缓冲液5000g以上速度离心10 50min，去除血淋巴细胞，收集离心上清液。于该上清液中加入硫酸铵至饱和度30 50%，0 10°C静至数小时使血蓝蛋白沉淀。后8000g以上离心即可得到初步纯化的血蓝蛋白沉淀。将此血蓝蛋白沉淀重新溶解于0. 01 0. IOmoI/L的Tris-HCl缓冲液中，于0 10°c条件下透析12 48h去除蛋白中高浓度硫酸铵。3)超高速离心软体动物血蓝蛋白为具有四级结构分子量巨大的蛋白分子。根据此特点，将2)中所得透析液IOOOOOg 200000g，0 10°C超高速离心2 5h，使血蓝蛋白从溶液中直接离心下来，从而与其它分子量小，无法离心沉淀的低分子量溶质分开。收集超高速离心后所得蓝色蛋白沉淀，既可得到纯度为95%以上的钉螺血蓝蛋白样品。附图说明图I是本专利技术实施例中钉螺组织截取部位示意图。图2是本专利技术实施例中钉螺血蓝蛋白紫外吸收特征图谱。图3是本专利技术实施例中钉螺血蓝蛋白高压液相色谱(HPLC)检测图，A、B分别为该蛋白两亚基峰。具体实施方式实施例I批量取钉螺于玻璃板，机械压碎去壳，截取所需组织，机械挤压收集钉螺血淋巴液至离心管JpATris-HCl pH7. 0缓冲液，机械挤压搅拌使充分溶解，8000g离心20min，弃去沉淀；于清液中加入硫酸铵至饱和度33%，4°C静止2h，离心去上清得血蓝蛋白蓝色沉淀粗品。血蓝蛋白沉淀重新溶解与前述Tris-HCl缓冲液,4 °C透析过夜；取至离心管180000g，4 °C离心3. 5h，弃去上清液，再次得到蓝色蛋白沉淀，沉淀溶于0. 05M Tris-HCl (pH7. 0，含5mM CaCl2, 5mM MgCl2)缓冲溶液中。蛋白纯度为95%以上。实施例2批量取钉螺于玻璃板，机械压碎去壳，截取所需组织，机械挤压收集钉螺血淋巴液至离心管；机械挤压榨取并收集血淋巴，IOOOOg离心50min除去剩余组织碎片等杂质；加入 Tris-HCl pH7. 0缓冲液溶解血淋巴，并加入硫酸铵至饱和度43%，8°C静止3h使蛋白沉淀， 离心去上清得血蓝蛋白蓝色沉淀粗品。血蓝蛋白沉淀重新溶解与前述Tris-HCl缓冲液,8 °C透析过夜；取至离心管180000g，6 V离心4. 5h，弃去上清液，再次得到蓝色蛋白沉淀，沉淀溶于0. 08M Tris-HCl (pH7. 0，含 5mM CaCl2, 5mM MgCl2)缓冲溶液中。蛋白纯度约为 95%。权利要求1.，其特征在于将钉螺经机械挤压、组织剥离、血淋巴提取、蛋白质分离与纯化，制备高纯度的钉螺呼吸蛋白。2.根据权本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范小林，李永东，郭道义，李勋，张云，曾丹，
申请(专利权)人：赣南师范学院，
类型：发明
国别省市：