本发明专利技术提供了一种蒙古黄芪异黄酮合成酶基因，该基因从蒙古黄芪克隆分离而得，其全长ｃＤＮＡ长度为１，９９５ｂｐ，其中开放阅读框位于１０６－１６８４位核苷酸，详细序列如表１。蒙古黄芪异黄酮合成酶是蒙古黄芪异黄酮合成的第一个关键酶，蒙古黄芪异黄酮合成酶基因控制着蒙古黄芪异黄酮合成酶的合成和表达，因此该基因对蒙古黄芪异黄酮合成酶开发有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
所属领域本专利技术涉及一种在蒙古黄芪(Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus)中表达的异黄酮合成酶基因及其核苷酸序列，即蒙古黄芪异黄酮合成酶(Astragalusmembranaceus Bge.var.mongholicus 2-Hydroisoflavone Synthase，AMIFS)的基因及其核苷酸序列。
技术介绍
异黄酮是豆科(Leguminosae)植物抗微生物的植保素，参与防御病原体的侵染；一些异黄酮类化合物能够阻止害虫的侵食(Phytochemistry，1986，25979-995；PhysiolPlant，1995385-392)。异黄酮在豆科植物与土壤微生物形成根瘤菌的早期反应中起信号作用(Annu Rev Phytopathol，1995，33345-368)。同时，异黄酮对人体有很多的好处，引起了人们的广泛关注，如抗肿瘤(J Natl Cancer Inst，1991，83541-546)、防治冠状心脏病(BioFactors，2000，12209-215)、减轻更年期综合症(International Journalof Gynecology & Obstetrics，1995，5163-64)和预防骨质疏松症(Menopause，1998，59-15)等；近20年来异黄酮在生物学方面的应用研究发展迅速。异黄酮是苯丙氨酸代谢分枝途径中的次生代谢物。在异黄酮合成中最关键的环节是类黄酮代谢进入异黄酮代谢的反应步骤，该步骤由异黄酮合成酶催化。蒙古黄芪异黄酮合成酶是蒙古黄芪异黄酮合成的催化酶，在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因及其核苷酸序列。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种新的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因及其全长cDNA序列。在本专利技术中，“分离的”cDNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在产生本专利技术的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因时，可以将蒙古黄芪异黄酮合成酶基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本专利技术的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长cDNA序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。获得有关的序列后，用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本专利技术蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的核苷酸序列。然后，可将该核苷酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。表2为本专利技术的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因与大豆异黄酮合成酶基因全长cDNA序列(GenBank Accession No.AF195798)的同源比较图。下面结合具体步骤，进一步阐述本专利技术。应理解，这些步骤仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列步骤中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆实验指南》、《实验室手册》(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。步骤1蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的克隆1.组织分离(isolation) 蒙古黄芪种子来源于山西农业大学，经25℃暗培养4d，用10mmol/L还原型谷光甘肽诱导10h后，取其根部，用液氮速冻。2.总RNA的分离(total RNA isolation)和检测取根部，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，电泳图谱呈现出3条清晰可区分的条带，其中28SRNA∶18S RNA比值约为2∶1，表明总RNA基本上未降解，可用于蒙古黄芪异黄酮合成酶基因全长克隆。3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行(1).RT-PCR根据大豆和其它豆科植物异黄酮合成酶基因的核苷酸保守序列，设计保守引物RT-F(SEQ ID NO.1)和RT-R(SEQ ID NO.2)，采用RT-PCR的方法(TaKaRa试剂盒)，得到1995PX1(673bp)连接到T-easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列与己知豆科植物如大豆(Glycinemax)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和刺甘草(Glycyrrhiza echinata)的异黄酮合成酶基因的同源性分别为81％、84％、84％，故初步认为它是一个异黄酮合成酶基因。(2).3′-RACEAP反转录总RNA，得到第一链cDNA，PCR(AUAP+1995PXF1(SEQ ID NO.3))得到1995PX1(898bp)，其它过程同(1)所示，测序结果已有的数据库(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列与已知豆科植物如大豆、鹰嘴豆和豌豆(Pisum sativum)的异黄酮合成酶基因的同源性分别为83％、83％、82％，故可进一步确认它是一个异黄酮合成酶基因。(3).5′-RACE第一轮PCR(AAP+1995PR1(SEQ ID NO.4))第二轮PCR(AUAP+1995PR2(SEQ ID NO.5))得到1995PX 2(970bp)其它过程如同(1)所示。(4).PCR扩增1995PX编码区通过组合使用上述3种方法，拼接候选的蒙古黄芪异黄酮合成酶基因的全长cDNA序列，在该序列(至少包含完整的开放读框)的基础本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蒙古黄芪异黄酮合成酶基因，其特征是：从蒙古黄芪克隆分离而得，该基因的全长ｃＤＮＡ长度为１，９９５ｂｐ，其中开放阅读框位于１０６－１６８４位核苷酸，详细序列为：１ ＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＡＧＣＴＧＴＴ ＴＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＣ５１ＴＴＡＣＴＴＧＴＴＣＧＴＴＣＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡ１０１ＡＧＡＣＧＡＴＧＴＴＧＴＴＡＧＡ ＡＣＴＴＧＣＡＧＴＡＡＣＴＣＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＣＴＣＴＴＣ１５１ＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴ２０１ＴＣＣＴ ＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＧＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＡＴＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣ ２５１ＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＴＣＴＡＧＧＴＧ ＡＡ３０１ＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＧＣＧＴＴＧＴ３５１ＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡ ＡＡＣＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＴ４０１ＣＴＴＣＣＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＴＴＡＧＡＣＧＣＣＴＣＡＣＣＴＡＴ４５１ＧＡＴＡＡＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＣ ＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＡＧ５０１ＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴＧＡ５５１ＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡ ＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＡＡＧＧＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧ ６０１ＡＧＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴＧＴＴＡＣＣＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧ６５１ ＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＡ７０１ＧＡＧＡＴＡＴＴＧ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑金贵，张丹凤，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]
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