过量表达脂肪酸转运蛋白基因和编码β-氧化途径酶的基因以通过假囊酵母发酵产生更多核黄素制造技术

本发明专利技术涉及一种在假囊酵母属的基因修饰生物中产生核黄素的方法，其中所述基因修饰与所述生物的脂肪酸摄取和/或β‑氧化途径相关，所述方法包括在培养基中培育所述生物并从培养基分离核黄素。本发明专利技术还涉及一种通过基因修饰所述生物，提供属于假囊酵母属(Eremothecium)的核黄素积累型生物的方法，涉及通过这种方法获得的生物，以及这类基因修饰生物增加核黄素积累的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及一种在阿舒囊霉属(Ashbya)或又称作假囊酵母属(Eremothecium)的基因修饰生物中产生核黄素的方法，其中所述基因修饰与所述生物的脂肪酸摄取和/或β-氧化途径相关，所述方法包括在培养基中培育所述生物并从培养基分离核黄素。本专利技术还涉及一种通过遗传修饰所述生物，提供属于假囊酵母属(Eremothecium)的核黄素积累型生物的方法，涉及通过这种方法获得的生物，以及这类基因修饰生物增加核黄素积累的用途。背景核黄素由全部植物和众多微生物如真菌、酵母或细菌产生。核黄素是细胞代谢的基本组分，因为它充当黄素辅酶黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体，所述黄素辅酶是氧化还原反应中的重要电子载体并且参与感光、DNA保护等。高等真核生物(包括人)不能合成核黄素，从而核黄素已经获得维生素状态(维生素B2)。人体中维生素B2缺乏导致口腔粘膜和咽粘膜炎症、皮肤褶皱中瘙痒和炎症及皮肤损伤、结膜炎、视力降低和角膜混浊。在婴儿和儿童中，生长抑制作用和体重减轻可能发生。因此，不得不向人或动物膳食补充核黄素。因此将它添加至饲料和食品原料并且也可以作为食品着色剂使用，例如用于蛋黄酱或冰淇淋中。核黄素可以按化学微生物方式产生。合成核黄素的化学方案基于一个使用D-核糖例如作为原料的多步骤过程。产生核黄素的微生物方案基于几种微生物天然合成核黄素、尤其在合适原料如植物油存在下天然合成核黄素的潜力。称作核黄素生产者的微生物包括无名假丝酵母(Candidafamata)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和假囊酵母属物种(Stahmann,2010,IndustrialApplications,TheMycotaX,第2版,Springer,Berlin,Heidelberg,第235–247页)。尤其，将假囊酵母属(Eremothecium)(前称阿舒囊霉属(Ashbya)；属于酵母菌科(Saccharomycetaceae))的丝状半子囊菌真菌鉴定为强力核黄素生产者。在过去几年中，已经深入研究并分析了产生核黄素的物种棉假囊酵母(Eremotheciumgossypii)并且其基因组已经测序。在棉假囊酵母(E.gossypii)(棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii))中，发现核黄素生产阶段与几种黄素生物合成基因(例如RIB基因RIB1、2、3、4、5和7)的转录的强烈增加相关。因此，经开发了核黄素生产菌株，所述菌株涉及这些基因的过量表达，例如通过整合额外的拷贝进行，如WO95/26406或WO99/61623中所概述。另外，可能阐明假囊酵母的核黄素生物合成途径(Fischer和Bacher,2005,NatProdRep,22,第324-350页)。基于更好地理解生物合成途径，通过以下方式可以增加假囊酵母中核黄素的产生：过量表达编码苏氨酸醛缩酶的GLY1并且破坏编码胞质丝氨酸羟甲基转移酶的基因SHM，这两者均干扰对产生核黄素必需的GTP代谢(还参见图1和2)(Stahmann,2010,IndustrialApplications,TheMycotaX,第2版,Springer,Berlin,Heidelberg,235–247)。发现通过干扰磷酸核糖胺合成影响核黄素产生的又一个重要调节基因是编码磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的ADE4，其可以作为抗反馈抑制形式提供(Jimenez等人2005,ApplEnvironMicrobol,71,5743-5751)。迄今鉴定的核黄素途径的修饰步骤基本上限于核黄素生物合成的终末步骤。然而，尽管有这些进展，所产生的核黄素的合成效率和量，尤其在假囊酵母真菌的遗传背景下，仍未最佳，而食品级和饲料级核黄素的需求正在持续增长。因此需要手段和方法允许在合适的生物如假囊酵母属真菌中进一步改善核黄素的产生和积累。本专利技术目的和简述本专利技术满足这种需求并且提供一种在假囊酵母属的基因修饰生物中产生核黄素的方法，其中所述修饰与脂肪酸摄取和β-氧化相关并且相比按照与基因修饰生物相同的条件下培养的没有该基因修饰的生物，所述基因修饰生物引起核黄素生产增加。因此，本专利技术在第一方面提供一种在假囊酵母属基因修饰生物中产生核黄素的方法，其中所述基因修饰与所述生物的脂肪酸摄取和/或β-氧化途径相关，所述方法包括在培养基中培育所述生物并从培养基分离核黄素。本专利技术尤其提供一种方法，其中所述基因修饰至少导致所述生物的AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性增加和/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性增加和/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)和/或AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)和/或AGOS_ABL018C(Faa1.4)活性增加。本专利技术人令人惊讶地发现，通过增加假囊酵母长链脂肪酸转运装置的组分的活性，可以实现核黄素产生或积累的增加。特别地，他们发现，通过增加AGOS_ACL174Wp(Fat1)的活性，可以实现核黄素产生或积累的明显增加，其中AGOS_ACL174Wp(Fat1)是假囊酵母长链脂肪酸转运装置的组分并且据信还涉及极长链脂肪酸活化。专利技术人进一步发现，通过增加涉及假囊酵母β-氧化途径的酶活性，可以实现核黄素产生或积累的明显增加。特别地，专利技术人进一步发现，通过增加AGOS_AER358Cp(Pox1)(即，涉及假囊酵母β-氧化途径的过氧化物酶体氧化酶)的活性，可以实现核黄素产生或积累的明显增加。另外，他们令人惊讶地发现，通过增加AGOS_AGL060Wp(Fox2)和AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)(即分别是假囊酵母β-氧化途径的水合酶/脱氢酶和3-酮酰-CoA硫解酶)的活性，核黄素产生或积累的明显增加变得可能。专利技术人还发现，通过增加AGOS_ABL018C(Faa1.4)(即，介导脂肪酸酯化并因而调节脂肪酸转运的长链酰基辅酶A合成酶)的活性，可以实现核黄素产生或积累的明显增加。这些结果出乎意料，在于迄今据信截止目前对所产生核黄素的产生效率或量具有影响的酶活性一般与核黄素生物合成的终末步骤相关或与导致甘氨酸或GTP作为核黄素合成的中间体使用的回补反应相关(还参见图1)，而早期生物合成反应如β-氧化步骤或脂肪酸转运活性尚未描述为产生核黄素的相关步骤，尤其在假囊酵母真菌的背景下是这样。使用假囊酵母额外地提供胜过使用其他微生物的几个优点。已经密切研究并分析了代表性物种棉假囊酵母，其基因组已经测序并且存在可用的允许遗传操作和工程化的几种分子工具。另外，可以展示假囊酵母能够在不同油源和含油废弃物(Park等人,2004,JAmerOilChemSoc,81:57-62)和甘油(Ribeiro等人,2012,JBasicMicrobiol,52:582-589)中生长，因此允许高效率利用这些廉价能量源作为产生核黄素的原料。在一个相关方面，本专利技术涉及一种在假囊酵母属生物中产生核黄素的方法，其中所述假囊酵母属生物经基因修饰以相比按照与基因修饰生物相同的条件下培养的没有所述基因修饰的生物，增加与脂肪酸摄取和/或β氧化途径相关的至少一种蛋白质的活性，所述方法包括在合适的培养基中培育所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在假囊酵母属(Eremothecium)的基因修饰生物中产生核黄素的方法，其中所述基因修饰与所述生物的脂肪酸摄取和/或β‑氧化途径相关，所述方法包括：(i)在培养基中、优选地在脂肪酸油存在下；并且任选地在非脂质碳源存在下培育所述生物；并且(ii)从所述培养基分离核黄素。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.09 EP 13196262.31.一种在假囊酵母属(Eremothecium)的基因修饰生物中产生核黄素的方法，其中所述基因修饰与所述生物的脂肪酸摄取和/或β-氧化途径相关，所述方法包括：(i)在培养基中、优选地在脂肪酸油存在下；并且任选地在非脂质碳源存在下培育所述生物；并且(ii)从所述培养基分离核黄素。2.通过基因修饰属于假囊酵母属的生物，提供属于假囊酵母属的核黄素积累型生物的方法，其中所述基因修饰与所述生物的脂肪酸摄取和/或β-氧化途径相关。3.属于假囊酵母属的核黄素积累型生物，其经基因修饰，其中所述基因修饰与所述生物的脂肪酸摄取和/或β-氧化途径相关。4.权利要求1或2所述的方法，或权利要求3所述的生物，其中所述基因修饰至少导致所述生物的AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性增加和/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性增加和/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)和AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性增加。5.权利要求2或4所述的方法，或权利要求3或4所述的生物，其中所述基因修饰生物能够积累比无基因修饰的可比较生物多至少5％至10％的核黄素。6.权利要求4或5所述的方法，或权利要求4或5所述的生物，其中(i)所述AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性增加归因于AGOS_ACL174W基因(fat1)的过量表达；和/或(ii)所述AGOS_AER358Cp(Pox1)活性增加归因于AGOS_AER358C基因(pox1)过量表达；和/或(iii)所述AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性增加归因于AGOS_AGL060W基因(fox2)和AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)的过量表达。7.根据权利要求6所述的方法或生物，其中所述AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)和/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)的过量表达由强的、优选地组成型和任选地可调节启动子传递，或通过在所述生物的基因组中提供AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)和/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)的至少第二拷贝传递。8.权利要求1、2、或4至7中任一项所述的方法或权利要求3至7中任一项所述的生物，其中所述基因修饰生物包含至少一个额外的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·霍夫，A·莫尔特，S·哈夫纳，O·策尔德尔，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE