本发明专利技术属于生物技术领域。本发明专利技术涉及一种重组人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白及其单克隆抗体的制备与应用，以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E4，于2013年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?NO：8412。杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有能够与重组人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白特异性结合的特点。所述的单克隆抗体可在纯化或检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白中应用，可用于动脉粥样硬化、糖尿病等代谢类疾病的早期检测，具有重大应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白及其单克隆抗体的制备和应用
本专利技术属于生物
。具体的说，本专利技术涉及一种重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体，以及转化有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述重组蛋白制备脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白制备杂交瘤细胞株，及其生产的单克隆抗体和应用。
技术介绍
脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein,FABP)是一类同源低分子质量的胞浆蛋白，自1972年脂肪酸结合蛋白被发现以来，发现至少存在9种不同类型的FABPs。不同的FABPs具有一定的组织表达特异性，根据其来源的不同可分为:肝型(live，L-)，肠型(intestinal, 1_),心脏型(heart, H-),脂肪细胞型(adipocyte, A-),表皮型(epidermal,E-),回肠型(ileum, IL-),脑型(brain, B-),髓磷脂型(myelin, M-),睾丸型(testis, T-)FABP。不同类型的FABP分子量大约在14_15kDa之间，含有126-137个氨基酸，不同类型的FABP的氨基酸序列15% -70%的同源序列。FABP作为一种脂质伴侣，其最基本的功能是与脂肪酸特异性结合，并将脂肪酸从细胞膜转运到脂肪酸在细胞内被利用的位置，参与脂肪酸的摄取、转运、酯化和β_氧化等一系列过程，调节脂肪酸的氧化以及磷脂、甘油三酯的代谢。此外，FABP家族成员还与细胞生长和增殖的调节有关。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白是细胞内脂肪酸结合蛋白超家族成员之一，编码132个氨基酸，相对分子质量为14588Da。其最早是在脂肪组织中被发现，广泛存在于体内多种组织和细胞内，但主要表达于脂肪细胞和巨噬细胞中，参与脂肪酸的摄取、转运、酯化和β_氧化等过程，调节脂肪酸的氧化以及磷脂、甘油三酯的代谢。研究表明其与代谢综合征及动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关，因此，特异性检测识别人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白显得尤为重要。目前，以免疫学为基础的血清学检测，由于其操作简便，结果易于判定，已成为主流方向，该方法主要是通过制备得到的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体实现对人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的特异性检测。
技术实现思路
设计目的:通过设计一种重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的特异性检测识别。设计方案:为了实现上述设计目的。本申请:(1)以人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白为靶抗原，采用大肠杆菌偏爱密码子，将其氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的表达。(2)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体pET-28a(+)中，构建重组蛋白表达载体。(3)将重组蛋白表达载体转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(4)重组蛋白表达菌株大规模培养后，收集菌体，超声破菌并低温离心后，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析，洗脱得到纯化的重组蛋白。(5)用纯化后的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后,取其脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株。(6)将杂交瘤细胞株制备小鼠腹水，使用辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体。(7)纯化得到的单克隆抗体在检测或纯化人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白中的应用。(8)纯化得到的单克隆抗体在制备人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白检测试剂中的应用。(9)所述的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白检测试剂优选检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的Western Blot试剂、ELISA检测试剂。本专利技术的有益效果:本专利技术构建了人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达载体，将其转化大肠杆菌感受态细胞，制备人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达菌株，并发酵表达、纯化得到人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白。以其作为免疫原，经过皮下免疫、常规细胞融合、筛选及亚克隆，获得了能够稳定分泌抗人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA、WesternBlot等方法鉴定，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性识别人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白，效价高、特异性强。本专利技术人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的应用如下: (I)应用该抗体可通过Western Blot检测脂肪组织中的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达。(2)应用该抗体可建立ELISA检测试剂盒定量检测各种体液如血液、血清、尿的人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白水平。(3)应用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白。(4)应用该抗体进行免疫组化检测脂肪组织中人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达量。综上所述，本专利技术成功构建了人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白表达载体，并纯化得到了人脂肪细胞型脂肪酸结合重组蛋白。此外，成功制备了抗人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，该抗体具有效价高、特异性强的特性，为快速检测人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白提供了关键技术。【附图说明】图1是不同浓度咪唑从镍琼脂糖亲和层析柱洗脱目的蛋白的SDS-PAGE电泳图。图2是杂交瘤细胞染色体图。图3是纯化后的单克隆抗体电泳图。图4是Western Blot检测单克隆抗体与重组脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的特异性反应图。生物材料保藏信息杂交瘤细胞株2E4，于2013年10月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称=CGMCC ;保藏地址为中国科学院北京微生物研究所；保藏号为CGMCC NO:8412。【具体实施方式】实施例1:优化编码重组蛋白的核苷酸序列为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No:2所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和Xhol对应的核苷酸序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成后的目的基因克隆于PGH载体(上海捷瑞生物工程有限公司)中。实施例2:构建重组蛋白表达载体用限制性内切酶BamHI 和 Xhol (Thermo scientific Fermentas)于 37°C分别对含目的基因的PGH载体和pET-28a (+)载体(德国Novagen公司)进行双酶切2小时，酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(本专利技术所使用的胶回收试剂盒均来自于南京天为生物科技有限公司)。使用T4连接酶(Thermoscientific Fermentas)将回收的目的基因和pET_28a(+)载体按一定的比例于4°C连接12小时，然后转化DH5 α感受态细胞，并涂布于含卡那霉素抗性(50 μ g/mL)的LB平板，于37°C恒温培养12小时之后，于平板上提取单克隆菌落至含卡那霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液体培养基中，37°C恒温摇床培养12小时之后，采用质粒纯化试剂盒(本专利技术所使用的质粒纯化试剂盒均来自南京天为生物科技有限公司)提取质粒，经BamHI和Xhol双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。实施例3:构建重组蛋白表达菌株将构建好的重组 表达载体转化BL21感受态细胞，并涂布于含卡那霉素抗性50 μ g/mL)的LB平板，于37°C恒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有如序列表SEQ?ID?No：1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有如序列表SEQ ID No:1所不的氣基酸序列。2.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示，可编码权利要求I所述的重组蛋白。3.一种质粒载体,其特征在于该质粒载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。4.一种菌株，其特征在于该菌株包含权利要求3所述的质粒载体。5.一种抗人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体，其制备方法包括:合成权利要求2所述的核苷酸序列，并连接到质粒载体上，构建重组蛋白表达载体，转化大肠杆菌，筛选得到重组蛋白表达菌株，大规模培养后，纯化获得重组蛋白，多次免疫Balb/c小鼠后，取其...
【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，缪小亮，李诗，尹鸿萍，王旻，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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