本发明专利技术公开了一种定量检测人心型脂肪酸结合蛋白(hFABP)的荧光免疫层析方法及其试剂盒。本发明专利技术的定量检测hFABP荧光免疫层析方法是利用量子点的优良荧光特性，结合双色标记技术及免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明专利技术具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明专利技术试剂盒对hFABP进行的定量检测，可同时检测全血、血清及血浆样品，从而为急性心肌梗塞的早期筛查和预后评估提供了一种简便、准确、特异、价廉的检测工具，适用于各级医院，特别有助于在基层医院及诊所的广泛推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检验领域，特别涉及一种利用人心型脂肪酸结合蛋白相关的免疫反应及荧光检测技术，以早期、敏感、特异的定量筛查和检测急性心肌梗死。
技术介绍
急性冠脉综合征(ACQ是冠心病中重要的急性事件之一，主要分为急性心肌梗死 (AMI)、不稳定心绞痛(UA)以及心源性猝死(SCD)，其发病率和病死率均较高。但若能在发病后及早辨别高危患者并进行再灌注治疗，则病死率及预后将会有明显改善。其中，心脏标志物在ACS的诊断及预后过程中，扮演着至关重要的角色。目前，常用的心脏标志物包括肌钙蛋白(cTn)、肌红蛋白(MYO)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)等。因ACS具有发病急、危害大的特点，所以选出特异性高的早期心脏标志物，进行提早诊断，及时治疗，这对于ACS患者而言具有非常重要的意义。心型脂肪酸结合蛋白(hFABP)由132个氨基酸组成，分子量为15KDa，是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高度心脏特异性。在心肌缺血损伤出现后，hFABP可以早在胸痛发作后1 3小时出现于血液中，6 8小时达到峰值，而且血浆水平在M 30小时内恢复正常。在AMI患者症状发作后的第一个对小时内连续测量hFABP可以①识别对再灌注疗法灵敏的患者；②发现围手术期AMI患者；③早在开始血栓溶解疗法后30分钟区别再灌注和未灌注梗塞相关动脉的患者；④若它在症状发作后10小时内出现，可以发现再梗塞；⑤能准确估计心肌梗死面积以提供重要的预后信息。与其它几种常用心脏标志物于心肌损伤后出现在血液中的时间和浓度变化对比发现，在心肌损伤早期(6小时内)，较其它心脏标志物而言，hFABP和MYO在诊断评估方面具有明显的时间优势。其中，MYO也是一种低分子量细胞质蛋白，存在于骨骼肌和心肌细胞中，因在炎症、局部缺血、SLE、休克及皮肌炎等情况下亦会引起MYO的血液浓度升高，因此作为心肌细胞损伤的诊断指标具有特异性较低的特点。而hFABP相对于MYO具有着高度的心肌特异性，所以作为心肌损伤的早期标志物，选择hFABP更为理想。目前，传统的心肌标志物检测方法主要包括放射性免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫法及胶体金免疫层析法等。其中，放射性免疫法因涉及放射性物质，存在放射线辐射和污染的缺点；酶联免疫法操作复杂，检测耗时长；化学发光法对技术要求高，测试成本高， 不易在临床实验室中进行常规开展；而胶体金免疫层析法虽然具有样品用量少，简便快速， 便宜的优势，然而当遇到某些样品中目标分析物含量较低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度低。在免疫层析系统中，除胶体金、胶体硒、乳胶颗粒及碳颗粒以外，量子点亦可被用作可视或可被仪器检测的指示物质。它具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等众多优点，在荧光检测领域具有取代传统有机荧光染料的潜力，已成为新一代生物荧光标记物。对胶体金免疫层析而言，定性/半定量分析是依据胶体金颗粒对光的吸收和散射进行检测的。与检测荧光强度相比，具有灵敏度低、定量不准确等缺点。因此，基于量子点及免疫层析的诸多优势，需要研制一种利用量子点荧光定量检测心肌损伤早期标志物(hFABP)的方法，弥补现有技术中存在污染、操作步骤繁琐、成本高或灵敏度低、定量不准确的不足之处。
技术实现思路
本专利技术的目的在于将可用于急性心肌梗死早期检测的生化标志物心型脂肪酸结合蛋白(hFABP)与免疫层析技术及荧光检测技术相结合，设计出一种快速定量检测急性心肌梗死的免疫试纸条，以用于AMI的早期筛选和诊断评估，解决各级医院，特别是基层医院中缺少快速、简便筛查早期AMI有效手段的现状。实现上述目的的技术方案如下步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将人心型脂肪酸结合蛋白的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为 550 1300nm ；步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应心型脂肪酸结合蛋白的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现人心型脂肪酸结合蛋白的定量检测。本专利技术提供的一种定量检测hFABP的荧光免疫层析的方法，是一种以量子点为荧光信号，采用双色标记技术，在免疫层析试纸条上实现hFABP快速灵敏检测的方法。本专利技术定量检测hFABP的荧光免疫层析方法能够解决现有荧光免疫层析技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的不足和缺陷，可实现对微量样品的检测。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10 1000倍。本专利技术采用化学交联或生物分子间特异性作用将hFABP的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，其中所述特异性抗体为抗hFABP的单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术中的化学交联为当量子点表面存在活性基团时，可与特异性抗体直接反应，不需用化学交联剂；反之，则需采用化学交联剂将抗体与量子点相偶联。其中，化学交联剂包括1-乙基-3-(3- 二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及戊二醛等。作为优选，在本专利技术的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行蛋白修饰。其一般步骤为将纯化后的量子点溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白质，以缓冲液作为反应介质，培育4小时，加入甘氨酸封闭，并以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白修饰的量子点荧光纳米颗粒。生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选， 在本专利技术的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统的结合方式对标记物进行量子点修饰，该结合方式具有放大信号的作用。具体为将生物素连接到蛋白质分子表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，将蛋白质分子偶联到链霉亲和素修饰量子点的表面。为了提高信号与背景的区分度，本专利技术选用发射光波长为550 1300nm的量子点。因在紫外照射下，层析膜、底板和扣卡的荧光强度在550nm以下远强于550nm以上，从而对低浓度hFABP检测时产生一定的影响，故优选发射波长大于550nm的量子点。此外，层析膜、底板和扣卡在近红外区域(750 1300nm)荧光强度极弱，结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750 1300nm)进一步提高灵敏度。本专利技术所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe, PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 组成的组中选择的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王秀利，
申请(专利权)人：深圳康美生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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