心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种心型脂肪酸结合蛋白测定试剂及制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。由R1试剂和R2试剂构成，所述的R1试剂是由牛血清蛋白溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（鼠）胶乳溶解于纯化水中所形成的溶液。将发明专利技术应用于心型脂肪酸结合蛋白的测定，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂及其制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料

技术介绍
心型脂肪酸结合蛋白(hFABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白。它具有高度心脏特异性(也就是主要在心脏组织中表达)，但在心脏以外的组织中也有低浓度表达。心肌缺血性损伤出现后，hFABP可以早在胸痛发作后1-3小时在血液中被发现，6-8小时达到峰值而且血浆水平在24-30小时内恢复正常。心脏脂肪酸结合胞质蛋白由132个氨基酸组成，分子量为15kDa。心型脂肪酸结合蛋白(hFABP)基因位于染色体I上。它是心脏最丰富的蛋白质之一。hFABP结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶A的运输，活跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。临床证明：在心肌损伤方面心型脂肪酸结合蛋白比肌红蛋白、CK-MB更具有临床价值，具体如下：(1)在心肌损伤的早期诊断中h-FABP更灵敏，是由于：在心肌中高浓度；在细胞质中限制；低分子量和面积小；相对组织特异性；与心脏以外组织中CK-MB的分布相似，以及在心肌损伤后早释进入血浆和尿液。(2)h-FABP在ACS发病早期可迅速释放到血液中，对于ACS的诊断具有时间优势，同时对心肌损伤具备高特异性、高灵敏度、高符合率的特点；h-FABP浓度在ACS长期预后中，可有效鉴别出AMI、心衰及不稳定心绞痛等不良事件的高危患者；(3)h-FABP与肌钙蛋白联合检测可提高诊断敏感性，对ACS更具诊断价值。(4)hFABP的早期使用可以克服急性胸痛早期心肌肌钙蛋白检测的陷阱。心肌肌钙蛋白在循环中越持久，可能越有助于急性心肌损伤的后期诊断。目前国内测定心型脂肪酸结合蛋白的方法主要有：(1)质谱法，该方法操作步骤复杂，价格昂贵，不适于在临床常规开展。(2)非竞争夹心ELISA，该方法定量准确性差，操作时间长，自动化程度低，一般只用于定性检测。基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有心型脂肪酸结合蛋白在测试过程中存在的上述缺陷，本专利技术首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便，采用国内外先进的胶乳增强免疫比浊法，适用于临床全自动或半自动生化分析(手工加样品、试剂)的心型脂肪酸结合蛋白测定试剂。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：一种心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂，由R1试剂和R2试剂构成，所述的R1试剂是由牛血清蛋白溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(鼠)胶乳溶解于纯化水中所形成的溶液。进一步的，作为优选：所述的R1试剂中，所述的缓冲液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，更优选的，所述的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液的pH为7.2，浓度为40mmol/L；牛血清蛋白，其浓度为50g/L。所述的R2试剂中，抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(鼠)胶乳浓度为5ml/L。同时，本申请还提供了一种具有上述特征心型脂肪酸结合蛋白测定试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)R1试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；加入牛血清蛋白搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(2)R2试剂配制：向纯化水中加入抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(鼠)胶乳，搅拌至完全溶解后定容；(3)对上述制备的R1试剂和R2试剂进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。进一步的，作为优选：所述的搅拌速度为450转/分。搅拌速度过高会导致剪切力过大，影响所配制溶体的表面张力和粘合力，搅拌速度过低则影响其混配效果，控制在450转/分时，在确保搅拌剪切适中的同时，也促进了其内所添加物质的融合。步骤(1)中，所述的纯化水初始体积为800ml，定容体积为1000ml。定容前后体积变化在20-30％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R1试剂浓度、溶液稳定性最佳。步骤(2)中，所述的纯化水初始体积为800ml，定容体积为1000ml。定容前后体积变化在20-30％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R2试剂浓度、溶液稳定性最佳。本专利技术的工作原理如下：标本中的H-FABP可与吸附在胶乳颗粒上的抗体产生抗原抗体的凝聚反应，形成抗原抗体复合物，其浊度的变化通过测定特定波长的吸光度值，即可算出标本中H-FABP的含量。(1)灵敏度评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求，以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度的差值(ΔA)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果：分析灵敏度26ng/mL吸光度差值(ΔA)≥0.0500ABS。(2)线性范围评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议，对试剂线性范围进行验证时，在待验证线性范围内选择5个浓度水平，每个浓度水平重复测定3次。(3)精密度评价试验精密度评价包括重复性和批间差，且至少评估二个浓度水平样本的精密度，其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此，重复性评价采用在重复性条件下，用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试，每个浓度重复测试10次；批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测试3个不同批号的试剂盒，每个批号测试3次。(4)准确度评价试验用不少于40个在检测浓度范围内的不同浓度的人源样品，以指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数(r)及每个浓度点的相对偏差。评估结果：三批试剂的重复性变异系数CV≤8％；相对偏差≤10％；试剂线性可达160ng/mL，分析灵敏度26ng/mL吸光度差值(ΔA)≥0.0500ABS。本专利技术利用胶乳增强免疫比浊法测定心型脂肪酸结合蛋白的方法，其优点是快速灵敏，准确性好，特异性高，稳定性好，操作简便，可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。附图说明图1为本申请中抗原-吸光度曲线图；图2为本申请中抗体-吸光度曲线图；图3为本申请中测定试剂的准确度柱状图。具体实施方式实施例1本实施例所用主要试剂：R1试剂：磷酸盐缓冲液：pH7.2，40mmol/L；牛血清蛋白：50g/L。R2试剂：抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(鼠)胶乳：5ml/L。1)R1试剂的配制①将800ml纯化水加入到适当容器中。②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。③称取3.58g磷酸氢二钾加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。④称取2.76g磷酸二氢钾加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑤称取6.68g牛血清蛋白加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑦搅拌十分钟以上⑧定容至1000ml。2)R2试剂的配制①将800ml纯化水加入到适当容器中。②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。③称取2.5g抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(鼠)胶乳加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。④搅拌十分钟以上。⑤定容至1000ml。3)试剂检验①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生本文档来自技高网...

【技术保护点】
心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂，其特征在于：由R1试剂和R2试剂构成，所述的R1试剂是由牛血清蛋白溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（鼠）胶乳溶解于纯化水中所形成的溶液。

【技术特征摘要】
1.心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂，其特征在于：由R1试剂和R2试剂构成，所述的R1试剂是由牛血清蛋白溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（鼠）胶乳溶解于纯化水中所形成的溶液。2.如权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂，其特征在于：所述的R1试剂中，所述的缓冲液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。3.如权利要求1或2所述的心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂，其特征在于：所述的缓冲液的pH为7.2，浓度为40mmol/L；牛血清蛋白，其浓度为50g/L。4.如权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白的测定试剂，其特征在于：所述的R2试剂中，抗人心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（鼠）胶乳浓度为5ml/L。5.如权利要求1所述心型脂肪酸结合蛋白测定试剂的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：方朝君，
申请(专利权)人：浙江达美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33