一种制备单克隆抗体的新方法技术

本发明专利技术涉及一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，用目的半抗原与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述连接体的抗体；将该连接体的抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体，保留目的半抗原的特异性抗体。本发明专利技术制备多肽抗体的方法对载体蛋白的要求高，所述载体为三级结构稳定且能够在原核细菌中大量表达的蛋白质。本发明专利技术应用范围非常广泛，理论上绝大多数半抗原均可以用此方法来制备相应的特异性抗体ＩｇＧ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是，具体而言，就是用相关的多肽来制备单克隆抗体的方法。
技术介绍
免疫反应是生物体对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。现有抗体制备技术是用抗原样品来反复的免疫动物，使免疫细胞产生有效的抗体(免疫球蛋白)。绝大多数的脊椎动物体内包含多种类型的免疫球蛋白，例如小鼠、大鼠和人体内都存在五种类型的免疫球蛋白IgM，IgD，IgG，IgE和IgA。其中IgM和IgG是在可溶性抗原引发的免疫反应中起主导作用的免疫球蛋白类型；本
中实际所用的免疫球蛋白主要是IgG。IgG家族又包含了四种IgG亚型其中人体内为IgG1，IgG2，IgG3和IgG4；小鼠体内为IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3。 多克隆抗体制备过程为注射抗原的方式多次免疫动物(比如小鼠，家兔和山羊)，然后定期(通常在注射抗原几周之后)收集动物的血清或者腹水，这些血清以及腹水中就含有目的抗原的抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇(抗原表位)，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。蛋白抗原分子上的表位是由线形的氨基酸残基或者非连续序列折叠形成的紧密三维结构，它们在抗原表面；线形的短肽序列组成的抗原表位通常为6个氨基酸残基甚至更少。 制备单克隆抗体的第一步是用相关抗原免疫动物，与制备多克隆抗体不同的是，免疫动物之后取动物的脾细胞，再将能分泌抗体的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，筛选能分泌目的抗体的杂交瘤细胞，并进行培养，收集它们分泌的特异性抗体。多肽的稳定性影响着制备单克隆抗体的工作。 以常规的多肽制备单克隆抗体为例，为了得到比较纯的多肽，比较常用的方法的是将目的抗原或者它的一个片断(半抗原)连接到载体上，例如牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase，GST)，人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)等等，但这样得到的连接体往往形成大量的包涵体，极大地影响后续实验的进行。 综上所述，为了不影响后续实验的进行，同时又能得到稳定的连接体，采用一种更有效的方法来制备单克隆抗体，而本专利技术可以解决这个问题。 附图说明 图1为用该方法制备得到的抗体免疫印记效果图； 图2为用该方法制备得到的抗体免疫组织化学效果图。
技术实现思路
，用多肽与特定的载体连接形成连接体，再用连接体去对动物进行两次或两次以上的免疫，经过对多肽的多次免疫应答，可以得到识别多肽抗原的脾细胞，再用脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，得到稳定表达多肽特异性抗体的杂交瘤细胞。 本专利技术的特征在于与多肽连接的载体构象稳定，疏水区较大且能在原核细菌中大量表达。本专利技术应用范围非常广泛，理论上大多数多肽就可与此载体连接来免疫动物获得相应的特异性抗体IgG。 具体实施方案 实施例1激素受体(Estrogen Receptor，ER)单克隆抗体的制备 本专利技术的一种用于制备单克隆抗体免疫方法的优选实施例为，用雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)和钙调磷酸酶催化亚基(CNA)的融合蛋白抗原样品对同一免疫动物进行两次或者两次以上的免疫，雌激素受体是一种配体激活型的转录因子，分子量约为60KD。优选实例用分子生物学技术克隆并在大肠杆菌中表达了雌激素和钙调磷酸酶催化亚基受体的融合蛋白；所述的动物为小鼠，免疫小鼠的次数为3次。 免疫小鼠将冷冻干燥的钙调磷酸酶合雌激素受体融合蛋白用5mM的磷酸盐缓冲液溶解，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化3小时；将乳化好的液体用一次性注射器注射小鼠，每只100μL，即50μg的抗原蛋白。 第一次加强注射两周后将制备的融合蛋白样品用弗氏不完全佐剂乳化，同样注射小鼠。第一次加强注射后10天左右，取小鼠的血清，通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定腹水抗体效价来检测抗体的存在。 第二次加强注射如果ELISA检测为阳性结果，即说明了抗体了存在，两周后，用弗氏不完全佐剂乳化融合蛋白，再次注射小鼠。 收集抗体及鉴定抗体第二次加强注射后的3天后注射H22型腹水瘤细胞，每次注射量2.2×106个细胞，7天后产生腹水。收集腹水以及血清，在12000rpm离心后，向血清和腹水中加入0.01％的叠氮化钠防止长菌，ELISA测定效价后，进行免疫印迹和免疫组织化学实验分析。 用1/10体积的1.0mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)(PH8.0)调解腹水抗体的PH值，将抗体溶液用蛋白G微珠层析柱过滤，用50mmol/L甘氨酸(PH3.0)洗脱滤柱。收集洗脱峰与装有1.0mol/LTris(PH8.0)的试管内，轻轻摇匀，得到纯化的雌激素受体的抗体。测定抗体的浓度，并进行电泳检测抗体的纯度。用小指管分装后，低温保存。权利要求1、一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于用目的半抗原与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述抗原样品的抗体；将该抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体，保留目的半抗原的特异性抗体。2、根据权利要求1所述的一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于所述半抗原为多肽，多糖，脂类或小分子量的有机分子。3、根据权利要求1所述的一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于所述载体蛋白为一种三级结构稳定的蛋白质，其耐热范围为60～120℃。4、根据权利要求3所述的一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于所述蛋白质为天然蛋白质或者通过分子生物学技术重组获得的蛋白质。5、根据权利要求3或4所述的一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于所述蛋白质能够在原核细菌中大量表达。6.根据权利要求1所述的一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于所述连接体为半抗原与载体蛋白通过分子生物学技术人工重组连接体，或者是用化学连接试剂人工合成的连接体。7、根据权利要求1所述的一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于所述纯化抗体的步骤包含用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体。8、根据权利要求1所述的一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于所述特异性抗体为特异性识别半抗原的IgG。全文摘要本专利技术涉及一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，用目的半抗原与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述连接体的抗体；将该连接体的抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体，保留目的半抗原的特异性抗体。本专利技术制备多肽抗体的方法对载体蛋白的要求高，所述载体为三级结构稳定且能够在原核细菌中大量表达的蛋白质。本专利技术应用范围非常广泛，理论上绝大多数半抗原均可以用此方法来制备相应的特异性抗体IgG。文档编号C07K16/18GK101289509SQ20071009016公开日2008年10月22日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日专利技术者宋奎锦, 张林刚 申请人:宋奎锦本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于：用目的半抗原与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述抗原样品的抗体；将该抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体，保留目的半抗原的特异性抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋奎锦，张林刚，
申请(专利权)人：宋奎锦，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]