突变神经胚素的聚合物偶联物制造技术

本发明专利技术公开一种二聚体，其包含与聚合物偶联的突变的神经胚素多肽。这些二聚体呈现延长的生物利用率，并且在优选实施方案中，相对于神经胚素的野生形式的延长的生物活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质化学、分子生物学、神经生物学、神经病学及疼痛治疗(pain management)领域。
技术介绍
神经营养因子是天然存在的蛋白质，其调节发育过程中的神经元存活，并调节成熟神经系统的可塑性及结构完整性。神经营养因子可从神经组织和非神经组织中分离出来。最近20年里已发现许多，神经营养因子根据它们的结构和功能这些神经营养因子可归类为超家族、家族、亚家族和个别种类。 神经营养因子超家族包括成纤维细胞生长因子(FGF)超家族、神经营养蛋白超家族及转化生长因子β(TGF-β)超家族。神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)相关的配体是TGF-β超家族内的一种蛋白家族。GDNF相关的配体包括GDNF、persephin(PSP)、neurturin(NTN)及神经胚素(Neublastin)(NBN；已知为artemin或enovin)。GDNF相关的配体家族成员以其七个保守的半胱氨酸残基为一种特征。这些残基形成分子内和分子间的二硫键，并产生二聚化多肽配体的三级及四级结构。这个家族的成员也共享通过多成分受体复合体来诱导信号的能力，所述多成分受体复合体由GFRα家族的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着的共同受体、GDNF相关的配体亚家族的成员及RET酪氨酸激酶受体组成。 活化的RET引发可至少部分引起GDNF相关配体的下游效应的信号转导级联。因此，RET的活化可代表通过GFRα受体途径影响下游细胞过程而起作用的疗法的一个可取的方面。 神经胚素归类在GDNF家族内，因为它与其它含有七个半胱氨酸基序的GDNF配体(如，在EP02/02691PCT公报US02/02319以及US02/06388描述的)共享同源区，并且因为它具有结合、活化作为GFRα复合体一部分的RET受体的能力。具体来说，神经胚素对与GFRα3-RET受体复合体的结合具有高选择性。在那方面，神经胚素与GDNF相关的配体家族的其他成员相比在其氨基酸序列内含有独特亚区。 目前的数据提示神经胚素在外周和中枢神经系统可具有保护性和再生性的作用，因此它可用作针对神经变性疾病的治疗剂。例如，资料提示神经胚素对所培养的来源于背根神经节和三叉神经节的感觉神经元以及培养的黑质(substantia nigra)多巴胺能神经元可具有促进存活的效应(Baloh等，Neuron 211291-1302(1998))。所以看来神经胚素可促进包括感觉神经元和多巴胺能神经元的神经元群体的存活。由于神经元的退化和功能异常与疾病的状态有关，因此这点是重要的。例如，感觉神经元和多巴胺能神经元的病理学分别是外周神经病变和帕金森病的致病基础。 因而，给予神经胚素可用于例如治疗与神经元的退化和功能异常相关的疾病。但是，神经胚素很快被机体清除，这可能影响神经胚素在治疗应用中所需的剂量范式(closing paradigm)。因而需要具有增强的生物利用率的经修饰的神经胚素多肽。因此，本专利技术的一个目的是识别显示增强的生物利用率的神经胚素的修饰形式。 专利技术概述 本专利技术提供了聚合物偶联的、突变的神经胚素二聚体。每一种二聚体含有包含第一氨基末端氨基酸的第一多肽和包含第二氨基末端氨基酸的第二多肽。每一种多肽各自含有(a)以与SEQ ID NO1的氨基酸8-113具有至少70％、80％、90％或95％的序列同一性为特征的氨基酸序列；(b)在位置16、43、47、80、81、109及111(按SEQ ID NO1编号)中的每个位置的半胱氨酸残基；(c)如下氨基酸残基16位C、18位L、25位V、28位L、29位G、30位L、31位G、36位E、40位F、41位R、42位F、43位C、45位G、47位C、80位C、81位C、82位R、83位P、91位F、93位D、105位S、106位A、109位C及111位C；以及(d)LGLG重复、FRFC基序、QPCCRP基序以及SATACGC基序。这种二聚体包括至少一种氨基酸取代(相对于SEQ ID NO1)，其可提供与聚合物偶联的内部聚合物偶联位点。 本专利技术也提供聚合物偶联的、突变的神经胚素二聚体，其含有第一多肽和第二多肽，其中每种多肽含有具有1-6个氨基酸取代的、SEQ ID NO6的氨基酸90-140，如95-120或100-110，每个取代提供了与聚合物偶联的聚合物偶联位点。本专利技术多肽的具体例子包括NBN113(SEQ ID NO2)、NBN140(SEQ ID NO6)、NBN116(SEQ ID NO7)、NBN112(SEQ ID NO8)、NBN111(SEQ ID NO9)、NBN110(SEQ ID NO10)、NBN109(SEQ ID NO11)、NBN108(SEQ ID NO12)、NBN107(SEQ ID NO13)、NBN106(SEQ IDNO14)、NBN105(SEQ ID NO15)、NBN104(SEQ ID NO16)、NBN103(SEQID NO17)、NBN102(SEQ ID NO18)、NBN101(SEQ ID NO19)、NBN100(SEQID NO20)及NBN99(SEQ ID NO21)。 优选地，二聚体中两个氨基末端氨基酸的至少一个偶联于聚合物。优选的氨基酸取代包括赖氨酸残基取代精氨酸残基(Raa#K；aa#是基于SEQID NO1的氨基酸编号)，及赖氨酸残基(Naa#K)或天冬氨酸残基(Naa#D)取代天冬酰胺残基。这种取代的具体例子是R14K、R39K、R68K、N95D及N95K(基于SEQ ID NO1编号)。特别优选的取代是N95K。 优选地，二聚体上的聚合物的总复合分子量(total combined molecularweight)是20,000-40,000Da。优选地，每种聚合物的平均分子量是2,000-100,000Da；更优选5,000-50,000Da；及最优选大约10,000到20,000Da。所述聚合物可为线性的或分支的。优选地，聚合物是一种聚亚烷基二醇组分，如，聚乙二醇(PEG)组分。在一些实施方案中，至少一种多肽是糖基化的。 在本专利技术的一些实施方案中，聚合物偶联的二聚体含有第一多肽和第二多肽，其中(a)每一种多肽各自包含SEQ ID NO1的100到110位氨基酸，(b)每一种多肽包含位于SEQ ID NO1中的氨基酸95的天冬酰胺-到-赖氨酸的取代，(c)以及该二聚体包含3或4个PEG组分，其中每个PEG组分的分子量大约10,000Da，并且每种PEG组分在氨基末端或95位赖氨酸处偶联。优选的实施方案是含有一对命名为3(4，)×10kDa PEG NBN106-N95K单体的同源二聚体。 本专利技术包括包含依照本专利技术的二聚体的药物组合物。在一些实施方案中，该组合物包含两种或更多种不同的依据本专利技术的二聚体。 本专利技术包括核酸，如，一种编码用于掺入本专利技术二聚体的多肽的DNA表达载体。本专利技术也包括由该核酸转化的宿主细胞。 本专利技术包括一种治疗哺乳动物神经性疼痛的方法。该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的本专利技术的二聚体。在一些实施方案中，该治疗有效量为从0.1μg/kg到1000μg/kg，从1μg/kg到100μg/kg，或从1μg/kg到本文档来自技高网...

【技术保护点】
与聚合物偶联的二聚体，其包含含有第一氨基末端氨基酸的第一多肽以及含有第二氨基末端氨基酸的第二多肽，其中每一种多肽各自包含：　　　　ａ）以与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的氨基酸８－１１３具有至少７０％的序列同一性为特征的氨基酸序列；　　　　ｂ）当所述多肽与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的编号一致时，在位置１６、４３、４７、８０、８１、１０９及１１１中每一位置的半胱氨酸残基；　　　　ｃ）当与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的编号一致时，如下每一种氨基酸残基；　　　　１６位Ｃ、１８位Ｌ、２５位Ｖ、２８位Ｌ、２９位Ｇ、３０位Ｌ、３１位Ｇ、３６位Ｅ、４０位Ｆ、４１位Ｒ、４２位Ｆ、４３位Ｃ、４５位Ｇ、４７位Ｃ、８０位Ｃ、８１位Ｃ、８２位Ｒ、８３位Ｐ、９１位Ｆ、９３位Ｄ、１０５位Ｓ、１０６位Ａ、１０９位Ｃ及１１１位Ｃ；以及　　　　ｄ）ＬＧＬＧ重复、ＦＲＦＣ基序、ＱＰＣＣＲＰ基序以及ＳＡＴＡＣＧＣ基序；　　　　其中至少第一多肽与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１相比包含至少一种氨基酸取代、插入或融合，并且其中所述取代、插入或融合提供与聚合物偶联的内部聚合物偶联位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪纳WY萨，R布莱克佩平斯基，葆拉A博里亚克肖丁，斯蒂芬S米勒，安东尼罗索曼多，劳拉西尔维安，
申请(专利权)人：比奥根艾迪克MA公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]