一种用于制备半抗原特异性抗体的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，用目的半抗原与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述连接体的抗体；将该连接体的抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体，保留目的半抗原的特异性抗体。本发明专利技术制备多肽抗体的方法对载体蛋白的要求高，所述载体为三级结构稳定且能够在原核细菌中大量表达的蛋白质。本发明专利技术应用范围非常广泛，理论上绝大多数半抗原均可以用此方法来制备相应的特异性抗体ＩｇＧ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于制备半抗原抗体的方法，具体而言，涉及一种 通过分子生物学手段或化学连接试剂构建半抗原与载体蛋白的连接体， 用连接体作为抗原样品多次去免疫动物，产生抗体并用特定手段进行纯 化半抗原特异性抗体的方法。
技术介绍
免疫反应是生物体对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原 刺激后可产生抗体。现有抗体制备技术是用抗原样品来反复的免疫动物， 使免疫细胞产生有效的抗体(免疫球蛋白)。绝大多数的脊椎动物体内包 含多种类型的免疫球蛋白，例如小鼠、大鼠和人体内都存在五种类型的 免疫球蛋白IgM， IgD， IgG， IgE和IgA。其中IgM和IgG是在可溶性抗原引发的免疫反应中起主导作用的免疫球蛋白类型；本
中实 际所用的免疫球蛋白主要是IgG。 IgG家族又包含了四种IgG亚型其中 人体内为IgGl， IgG2， IgG3和IgG4;小鼠体内为IgGl， IgG2a， IgG2b 和IgG3 。多克隆抗体制备过程为注射抗原的方式多次免疫动物(比如小鼠， 家兔和山羊)，然后定期(通常在注射抗原几周之后)收集动物的血清或 者腹水，这些血清以及腹水中就含有目的抗原的抗体。抗体的特异性取 决于抗原分子的决定簇(抗原表位)，各种抗原分子具有很多抗原决定簇， 因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。蛋白抗原分子上的表位是由线形的氨基酸残基或者非连续序列折叠形成的紧密三维结构，它们在抗原表面；线形的短肽序列组成的抗原表位通常为6个氨基 酸残基甚至更少。半抗原因其分子量小，缺乏免疫原性，所以在免疫动物时，很难诱 导产生特异性的细胞以及体液免疫反应。因此一般将半抗原与大分子载 体交联后制备成人工合成物，或者通过分子生物学重组技术构建半抗原 与载体蛋白的连接体，使这类半抗原物质随分子量增大而使其免疫原性 增强。以制备多肽的抗体为例，比较常用的手段是将目的多肽连接一个 载体蛋白，这类载体蛋白是常见的并且比较容易纯化的蛋白，例如谷胱 甘肽转移酶(glutathione-S-transferase, GST)，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin， BSA)，牛甲状腺球蛋白(bovine thyrogloblulin, BTG) 等等，再用这些连接体去免疫动物三到四次。之后取免疫动物的血清或 者腹水，再从中分离纯化得到目的多肽的抗体。制备高纯度的抗原是抗体制备的关键步骤之- ，但是很多抗原在现 有的纯化条件下，并不能满足作为优质抗原的要求。以制备多肽的抗体 为例，为了得到比较纯的抗原，尽管融合蛋白质经过亲和层析之后得到 很有效纯化，但是仍有相当的部分融合蛋白的纯度难以保证。另外，通 过融合蛋白作为抗原的方法制备的抗体不仅会识别目的抗原，还会识别载体蛋白。抗原亲和柱纯化抗体是一种解决这个问题的常用手段，通常 将目的多肽连接到层析介质之上，让目的多肽亲和目的抗体，再将所需要的抗体洗脱下来。对于基础科学研究，这种纯化 抗体的方法是可行的；但是对于抗体的产业化，这种方法成本很高，工 作量也比较大，周期较长，因为每生产一种抗体就需要合成一种相应的 抗体亲和纯化柱。因此在产业化过程中，利用现有资源，采用一种简便的方法来制备 具有良好特异性的抗体显得非常重要，而本专利技术恰好解决了这--难题。本专利技术的主要的特点为两点第一，需要使用特定的载体蛋白，载 体蛋白为适合免疫的优质蛋白，具备高度的三维结构稳定性，所使用的 载体蛋白均能在70X:左右水浴1小时的情况下保持活性，并且具有在大肠杆菌 中表达产量高，以及容易纯化等优点。本专利技术采用的载体蛋白，为几种 耐热蛋白，可以在常温下放置几周而不变性；并且在大肠杆菌中表达量 很高，每升培养基可以得到200毫克以上的蛋白；载体蛋白只需要简单的 纯化过程纯度就可以达到999L第二，本专利技术采用独特纯化抗体的方法， 即用载体蛋白亲和柱除去非特异性的抗体，从而得到特异性的目的抗体。 本专利技术的载体蛋白具有稳定性和产量高这些特性，决定了载体蛋白亲和 柱可以在生产过程中反复利用，大大降低了纯化的成本，同时也縮短了 抗体制备周期。并且本专利技术载体蛋白亲和柱同时能除去抗原样品屮的杂 蛋白相应的抗体。附图说明图1为本专利技术方法制备半抗原特异性抗体的流程图2为鉴定本专利技术方法制备的胰岛素抗体识别胰岛素，胰岛素A链与载体的融合蛋白，载体蛋白以及大肠杆菌的细胞提取物ELISA图3为鉴定本专利技术方法制备的人肿瘤坏死因子受体hTNFR55抗体识别 hTNFR55， hTNFR55与载体的融合蛋白，人肿瘤坏死因子受体hTNFR75， 载体蛋白以及大肠杆菌的细胞提取物ELISA图
技术实现思路
:本专利技术所要解决的技术问题在于，克服现有技术之缺陷而提供一种 产业化生产特异性抗体的方法。为实现上述目的，本专利技术采取以下设计方案用目的半抗原与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或 三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述 连接体的抗体；将该抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体， 保留目的半抗原的特异性抗体。本专利技术的流程简化成一个图例(图l)。所述载体蛋白为一种三级结构稳定并且具有耐热功能的蛋白质。所述载体蛋白为天然蛋白质或者通过分子生物学技术重组获得的蛋 白质，并且能够在原核细菌中大量表达的蛋白质。所述抗原样品为半抗原与载体蛋白的连接体，连接体为半抗原与载 体蛋白通过分子生物学技术人工重组连接体，或者是用化学连接试剂人 工合成的连接体。所述纯化抗体的步骤包含用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的 抗体。所述特异性的抗体为特异性识别目的抗原的IgG。本专利技术的一个重要目的是提供一种生产能识别目的蛋白分子的单一 线形表位的抗体技术，即一种独特的单克隆抗体技术。本专利技术的另一目的是提供一种纯化特异性抗体的方法，所采取的设 计方案为利用目的半抗原与载体蛋白的连接体为抗原样品，先通过免 疫动物，收集动物的血清或腹水，然后用载体蛋白亲和柱除去识别载体 的抗体，从而分离纯化目的半抗原的特异性抗体。本专利技术的优点是本专利技术制备抗体的方法对生产多肽抗体具有很大 的优势，制备的抗体特异性强，效价高，产量大，流程简单，成本低廉。本专利技术不受抗原样品的纯度的限制，因为载体蛋白的纯度决定了所携带 多肽的纯度，载体蛋白的纯度可以达到99%;并且少量杂抗原的相应抗体 可以通过载体亲和柱除去。本专利技术可以使得很多难以纯化的半抗原特异 性多克隆抗体得到迅速而有效的制备。并且本专利技术应用范围比较广泛， 理论上绝大多数的可溶性半抗原，如多肽，和其他的有机分子均可以用此种方法来制备相应的特异性抗体IgG。此外，本专利技术所制备的抗体，可以长期有效的保存。具体实施方案实施例l:人胰岛素多克隆抗体的制备本专利技术的一种用于制备抗体的方法的优选实施例为，用目的半抗原 与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述连接体的抗体；将 该抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体，保留目的半抗原的特异性抗体，所述目的半抗原为人胰岛素的A链；人胰岛素的A链是一种21个氨基酸组成的多肽。本优选实施例用分子生物学技术克隆并在 大肠杆菌中表达了人胰岛素A链与钙调素(CaM)融合蛋白CaM-ins本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备半抗原特异性抗体的方法，其特征在于：用目的半抗原与载体蛋白的连接体作为抗原样品对动物进行三次或三次以上的免疫，经过免疫动物对抗原样品的免疫应答，使其产生所述抗原样品的抗体；将该抗体用载体蛋白亲和柱除去载体蛋白所识别的抗体，保留目的半抗原的特异性抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨承刚，
申请(专利权)人：杨承刚，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]