本发明专利技术涉及寡核苷酸引物对、寡核苷酸组合物和包括寡核苷酸组合物的试剂盒及其检测方法，由序列为TGAYGGGCGACAATGTCC的上游引物PRRSVNSP2-F和序列为CGCAGACAAATCCAGAVG的下游引物PRRSVNSP2-R组成。本发明专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、能够对PRRSV经典株与高致病性变异株进行鉴别诊断，解决了临床样品检测中不能区分PRRSV经典株或高致病性变异株单独感染亦或共同感染的问题；2、特异性好，针对PRRSVNSP2具有高保守区设计引物，特异性强，无假阳性出现；3、灵敏度高，该方法的敏感性可达1TCID50/mL；4、简便快速。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物病毒分子生物学
，具体是一种用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的一步法RT-PCR检测方法，也涉及寡核苷酸引物对、寡核苷酸组合物和包括寡核苷酸组合物的试剂盒，适用于临床或科研中鉴别检测样品是否是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，或者是两者的共同感染。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Wensvoort等人在感 染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(LV);同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。目前，猪繁殖与呼吸综合征已在世界范围内流行，我国自1996年以来普遍存在该病。2006年6月起，我国南方一些省份的猪场暴发了一种“高热”综合征，发病猪的体温高于41°C，病猪食欲不振甚至废绝，腹部、耳尖及后躯发红，发病率达70% 100%，死亡率达50% 100%不等。该病传播迅速，在短短的半年内几乎传遍了大半个中国，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。传统的猪繁殖与呼吸障碍综合征诊断方法有多种，如检测病原的有病毒分离、免疫组化、免疫荧光试验等方法,检测抗体的有ELISA、血清病毒中和试验、间接免疫荧光试验、免疫过氧化酶单层试验等血清学方法，但这些诊断方法不同程度地存在诸如敏感性低、特异性差、需时长等的局限性。国内外已建立了针对所有PRRSV的RT-PCR方法，但此种方法只能检测是否有PRRSV感染，无法判断是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，亦或是两者共同感染。此外，已有的针对PRRSV高致病性变异株的RT-PCR检测方法，只能检测PRRSV高致病性变异株，无法判断是单一的PRRSV高致病性变异株感染，还是PRRSV经典株与高致病性变异株的共同感染。由于上述各方法的局限性，无法为我国快速有效地监控PRRS疫情提供有力的技术支持。因此，建立一种简便、快速、特异性强、敏感性高的PRRSV经典株与高致病性变异株的鉴别检测方法意义重大。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提出，目的在于克服现有检测PRRSV方法的不足，该方法只需要一对引物、一次检测便能判断检测样品中是否含有PRRSV经典株，或者含有PRRSV高致病性变异株，亦或是两者共同感染，该方法简便快速、特异性强、敏感性高，并且可以同时进行大批量的样品检测，可为PRRS疫情的监测、流行病学调查及防控提供有力的技术支持，具有良好的应用前景。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是寡核苷酸引物对，其特征在于由序列为 TGAYGGGCGACAATGTCC 的上游引物 PRRSV NSP2-F 和序列为 CGCAGACAAATCCAGAVG 的下游引物PRRSV NSP2-R组成。用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物，其特征在于包括如上所述的寡核苷酸引物对。一种用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的试剂盒，其特征在于包括如上所述的用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物。应用权利要求3所述的用于检测PRRSV经典株与高致病性变异株的试剂盒进行一步法RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤 1)将RT-PCR50 u L反应体系在PCR扩增仪上进行如下循环45°C 30min,94°C 5min，其扩增条件为94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 30 s ;进行30个循环后，在72°C下延伸10min，得到PCR扩增产物；所述的RT-PCR 50 y L反应体系由5 y L IOX buffer，0. 5 y L Taq polymerase (5U/U L), 0. 5 U L reverse transcriptase (5U/U L), 0. 5 U L RNaseinhibitor (40U/y L)，4 y L RNA 模板，5 y L dNTP (IOmM), I U L PRRSV NSP2-FC100 uM),I u L PRRSV NSP2-R (100 u M)和 32. 5 u L 灭菌水组成； 2)电泳称取I.2g琼脂糖放入500mL锥形瓶中，加入I XTAE电泳缓冲液lOOmL，于微波炉中熔解，再加入5 u L染色液混匀，在电泳槽模内放好梳子，倒入所得琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将PCR扩增产物5 u L混合I y L上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以100-150V电压于IXTAE电泳缓冲液中电泳，通过凝胶成像系统观察结果。本专利技术与现有技术相比具有以下优点 1、能够对PRRSV经典株与高致病性变异株进行鉴别诊断，解决了临床样品检测中不能区分PRRSV经典株或高致病性变异株单独感染亦或共同感染的问题； 2、特异性好，针对PRRSVNSP2具有高保守区设计引物，特异性强，无假阳性出现； 3、灵敏度高,经对反应体系及循环参数进行优化,该方法的敏感性可达ITCID5(l/mL ； 4、简便快速，仅I个小时，加上核酸的提取和琼脂糖凝胶检测，共需2-3小时。附图说明图I : 一步法RT-PCR检测PRRSV经典株与高致病性变异株电泳结果，注M. DL2000marker, I. PRRSV 经典株 CH_la，2. PRRSV 高致病性变异株 07HBEZ，3. H2O ； 图2 : —步法RT-PCR特异性试验电泳结果，注M. DL2000marker，I. PRRSV经典株CH-la, 2. PRRSV高致病性变异株07HBEZ，3.猪瘟病毒(CSFV)，4.猪伪狂犬病毒(PRV)，5.猪圆环病毒2型(PCV2)，6.猪细小病毒(PPV)，7.日本乙型脑炎病毒(JEV)，8.猪轮状病毒(RV)； 图3 :—步法RT-PCR敏感性试验电泳结果，注左图为PRRSV经典株CH-Ia，右图为PRRSV 高致病性变异株 07HBEZ ;M. DL2000marker，I. IO3 TCID5(l/mL，2. IO2 TCID50/mL, 3. 10TCID50/mL, 4. I TCID50/mL, 5. KT1 TCID5(l/mL，6. 1(T2 TCID50/mL, 7. 1(T3 TCID50/mL ； 图4 :一步法RT-PCR检测临床样品电泳结果，注M. DL2000marker，l-4、8、ll、15、21、23、24，PRRSV高致病性变异株阳性样品；9、10、12、13、16、17，PRRSV经典株PRRSV阳性样品；7、19，PRRSV经典株与高致病性变异株共同感染阳性样品；5、6、14、18、20、22，阴性样品。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。实施例仅用于说明本专利技术，不会限制权利要求书所详细描述的本专利技术 。本专利技术研究过程中用到的毒株包括猪瘟病毒(CSFV)，猪伪狂犬病毒(PRV)，猪圆环病毒2本文档来自技高网...
【技术保护点】
寡核苷酸引物对，其特征在于由序列为TGAYGGGCGACAATGTCC的上游引物PRRSV？NSP2？F和序列为CGCAGACAAATCCAGAVG的下游引物PRRSV？NSP2？R组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨克礼，田永祥，段正赢，刘泽文，郭锐，周丹娜，袁芳艳，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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