基因转运载体的制备方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种有效地制备基因转运载体的方法，该方法中，经由转化而导入的基因所表达的蛋白质活性和表达效率均良好。此外，本发明专利技术的另一个目的是提供含有该制备方法制备的基因转运载体的药物组合物，以及含有该耐受菌的实体瘤治疗剂。本发明专利技术通过以下方案来解决本发明专利技术的课题：在由厌氧性微生物形成的基因转运载体中，使编码前述目标蛋白质的DNA?5′末端侧，进一步具有含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列构成的肽，所述厌氧性微生物可以在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达（A）具有抗肿瘤活性的蛋白质、或（B）具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种由厌氧性微生物构成的，所述基因转运载体可用作实体瘤治疗剂，所述厌氧性微生物能够在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达(A)具有抗肿瘤活性的蛋白质、或(B)具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质。此外，本专利技术还涉及含有根据该方法制备的基因转运载体的药物组合物，以及含有该基因转运载体的实体瘤治疗剂。
技术介绍
近年来，对使用基因转运载体治疗恶性肿瘤的方法进行了各种研究，例如，对于厌氧菌梭菌(Clostridium),公开了使用了转化菌的针对肿瘤部位的基因转运方法(例如，参照专利文献1、2)。同样的，对于厌氧菌双歧杆菌(Bifidobacterium),期待将该菌的转化子作为益生菌(Probiotics)或感染性疾病口服疫苗的载体的应用(例如，参照专利文献3)，另外，对于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum),由于该菌在全身给药后蓄积在缺氧的实体瘤内，因而提示其可以用于治疗实体瘤(例如，参照非专利文献1、2)。另外，本专利技术人确认通过使用重组质粒pBLES100-S-e⑶进行转化，能够在重组微生物中表达胞嘧啶脱氨酶(EC3. 5. 4. I ;以下称为“⑶”)，所述重组质粒pBLES100-S-e⑶具有与来源于长双歧杆菌的组蛋白样DNA结合蛋白的启动子融合的大肠杆菌codA，所述胞嘧啶脱氨酶是将具有抗肿瘤活性的5-氟尿嘧啶(以下称为“5-FU”)的前药(前体)5_氟胞嘧啶(以下称为“5-FC”)转化为5-氟尿嘧啶的酶，并报道了可以期待该重组微生物，例如重组长双歧杆菌，在酶-前药疗法中的应用(例如，参照专利文献4和非专利文献3、4)。并且，为了将该⑶表达基因重组微生物应用到酶-前药疗法中，要求所述重组微生物对由⑶从5-FC转化的、至少是抗肿瘤活性有效浓度的5-FU有耐受性，因此，开发了表达⑶的5-FU耐受菌的制备方法，并进行报道(例如，参照专利文献5)。另一方面，对于这种CD，非专利文献5报道了在大肠杆菌中，编码CD的DNA内，引入将该CD的第314位(对应本专利技术的序列号28中的第315位)氨基酸从天冬氨酸替换为丙氨酸的突变之后，与突变前的野生型CD相比，突变的⑶将5-FC转化为5-FU的⑶活性增强至约2. 2倍(50/23)(参照非专利文献5Tablel.的中间部分)。针对在治疗恶性肿瘤中使用的重组菌的转化方法进行了各种报道，在上述文献中也报道了各种各样的转化菌的制备方法。例如，在专利文献3中报道了一种转化方法，其特征在于，包括下列步骤利用来源于双歧杆菌的质粒和来源于大肠杆菌的质粒制备在双歧杆菌和大肠杆菌中被相互复制的穿梭质粒的步骤、以及将编码目标蛋白质的目标基因连接到所述穿梭质粒进而制备重组载体的步骤；并且将制备所述穿梭质粒时使用的双歧杆菌用作被所述制备出的重组载体转化的宿主细胞。此外，例如，对于在构建所述重组质粒pBLES100-S-e⑶时使用的穿梭质粒PBLES100的制备方法，报道了由长双歧杆菌BK51的pTB6和大肠杆菌的pBR322构建的制备方法(例如，参照非专利文献6)。并且，公开了能够以与该穿梭质粒pBLESlOO相比超过100倍的高效率来转化长双歧杆菌的质粒PAVOOl和pBRASTAlOl的制备方法(例如，参照非专利文献7)。 像这样，虽然对可用于治疗恶性肿瘤的进行了各种报道，但是所有报道都是限定了在转化中使用的微生物和质粒等的方法，而转化方法本身则使用普通的转化技术，另外，这些方法也是以制备能够在目标患部表达目标基因的转化微生物本身为目的的方法，例如制备能够在目标患部表达基因的转化微生物的方法，所述基因为具有抗肿瘤活性的蛋白质或具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的基因，至今还没有报道以提高由目标基因表达的蛋白质本身的活性或表达效率为目的的制备方法。专利文献I :美国专利第6416754号公报专利文献2 :美国专利第6652849号公报专利文献3 :日本专利特表2004-519236号公报专利文献4 :日本专利特开2002-97144号公报专利文献5 :国际公布2006/109619号公报非专利文献I :Yazawa et al. Cancer Gene Ther.，7，269-274 (2000)非专利文献2 :Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat. , 66, 165-170 (2001)非专利文献3 Nakamura et al. , Biosci. Biotechnol.Biochem.，66，2362-2366 (2002)非专利文献4:Fujimori et al. , Curr. Opin. Drug Di scov.Devel.，5，200-203(2002)非专利文献5 :Sheri et al. , Protein Engineering, Design andSelection, 17(8):625-633(2004)非专利文献6:Matsumura et al. , Biosci. Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212 (1997)非专利文献 7 T a n a k a et al. , Biosci. Biotechnol.Biochem.，69(2):422-425 (2005)
技术实现思路
迄今为止报道的可用于治疗恶性肿瘤的，均是以制备能够在目标患部表达目标基因的重组菌本身为目的的方法，例如制备能够在目标患部表达基因的重组菌的方法，所述基因为具有抗肿瘤活性的蛋白质或具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的基因，至今还没有报道以提高由目标基因表达的蛋白质本身的活性或表达效率为目的的制备方法。然而，在使用基因转运载体的治疗方法中，由导入到转化微生物中的基因所表达的蛋白质的活性和表达效率都是重要的问题，当然需要由该转化微生物的基因所表达的蛋白质具有与由原来的野生型微生物具有的基因所表达的蛋白质相同的活性，并且，与原来的微生物具有的基因相比，能够同等地或更好地进行表达。本专利技术的课题在于提供一种有效地制备基因转运载体的方法，该方法中，经由转化而导入的基因所表达的蛋白质活性和表达效率均良好。另外，本专利技术的课题在于提供含有该制备方法制备的基因转运载体的药物组合物，以及含有该耐受菌的实体瘤治疗剂。本专利技术人报道了制备转化微生物的下列方法首先，选择表达CD的基因作为目标基因，所述CD在具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质中；作为整合该目标基因的质粒，将具有表达该CD的基因的大肠杆菌的质粒与来源于长双歧杆菌的质粒融合，制备质粒pBLESlOO-S-e⑶；发现可期待将使用该质粒重组长双歧杆菌105A形成的长双歧杆菌105A/pBLES100-S-e⑶用作治疗恶性肿瘤的基因转运载体；作为该制备方法，在 通过整合目标基因来制备该基因表达载体的工序中，使用与基因的表达有关的启动子，所述基因为编码来源于长双歧杆菌的组蛋白样DNA结合蛋白质(以下也称为“HU蛋白质”)的基因，通过将目标基因整合在该启动子下游，进而能表达目标基因(专利文献4)。本专利技术人对上述方法进行了认真研究，发现作为整合目标基因的融合质粒，将含有复本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA片段，该DNA片段具有含有来源于选自青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、假长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌以及长双歧杆菌的任意一种的双歧杆菌属细菌且编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子的DNA片段，在所述启动子和终止子之间具有编码胞嘧啶脱氨酶的DNA，所述编码胞嘧啶脱氨酶的DNA是，（a）除去序列号28的氨基酸序列的起始蛋氨酸的氨基酸序列，并且编码序列号28中记录的大肠杆菌CD的氨基酸序列中与第315位相对应的氨基酸天冬氨酸被丙氨酸取代的氨基酸序列的碱基序列；（b）在编码胞嘧啶脱氨酶的DNA的5′末端侧，具有编码序列号29的第1位到第4～18位中任意一位的氨基酸序列的碱基序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：嶋谷裕子，浜地芳典，松桥瞳，天野纯，谷口俊一郎，藤森実，
申请(专利权)人：阿内罗药物科学株式会社，
类型：发明
国别省市：