重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法技术

本发明专利技术涉及医药生物工程技术领域，是一种重组人胸腺肽α↓［１］在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法。本发明专利技术用ＰＣＲ将化学合成的人胸腺肽α↓［１］基因扩增并克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体中，经过ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体ｐＥＴ３２ｂ中硫氧还蛋白下游。将重组质粒转化至表达宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导，Ｚｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析纯化以及复性处理，从每升菌液中可获得３５ｍｇ硫氧还蛋白－胸腺肽α↓［１］融合蛋白。经凝血因子Ｘａ酶切、Ｚｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析以及反向高效液相色谱纯化获得３．８ｍｇ重组人胸腺肽。小鼠胸腺细胞凋亡实验表明，重组人胸腺肽能显著地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物工程
本专利技术更涉及一种重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法。
技术介绍
胸腺在动物的免疫系统中发挥着至关重要的作用。它通过产生一系列多肽来调节T细胞的成熟、分化和功能。1972年Goldstein等人对胸腺组织进行提纯和鉴定，发现了其中一种分子量为12600Da的活性成分(1)。后续研究又表明该蛋白是由三个分子量低于4000Da的多肽聚集而成(2)。胸腺素组分5就是其中之一，它具有强大的免疫促进作用，甚至在胸腺摘除或免疫缺陷的动物体内可替代胸腺重新构建免疫功能(3)。胸腺素组分5是由分子量从1000Da到15000Da不等的10至15种主要成分和20多种次要成分所组成。Goldstein通过对组分5的进一步纯化，获得了胸腺肽α1(thymosinα1，Thyα1)并对其氨基酸序列进行了测定。Thyα1由28个氨基酸组成，分子量为3108Da，N-末端存在乙酰化，其等电点为4.2。体内及体外的活性测定结果表明，胸腺肽的活性较组分5高10到1000倍(4)。临床数据表明Thyα1能够显著增强机体的免疫力，对肝炎病毒的复制繁殖具有显著的抑制作用(5-7)。胸腔组织中成分复杂，因此天然Thyα1的纯化步骤复杂，且得率很低。目前临床使用的Thyα1是采用化学合成制造，步骤繁琐。而且即使每步合成的效率较高，但多步合成的最终产率并不理想，所以生产成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题，提出一种重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法。本专利技术的技术解决方案一种重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法，其特征在于在DNA水平的重组人胸腺肽α1质粒的构建；目的基因在大肠杆菌系统中的表达；利用Zn-Sepharose亲和层析柱对目标蛋白的纯化；以及使用胸腺细胞对重组人胸腺肽进行体外活性鉴定。其中重组人胸腺肽α1的DNA序列为ATTGAGGGTCGCTCCGACGCTGCAGTTGACACCTCTTCCGAAATCACCACTAAAGACCTGAAAGAGAAAAAGGAAGTAGTTGAAGAGGCGGAAAACTAA；PCR扩增所使用的引物为5’引物GGTACCATTGAGGGTCGCTCCGACGCT，3’引物GAGCTCTTAGTTTTCCGCCTCTTCAACTAC。其中重组人胸腺肽pMD18-T质粒在大肠杆菌菌株DH5α中的扩增。其中重组人胸腺肽pET32b质粒在大肠杆菌菌株BL21中的表达。其中融合重组人胸腺肽通过亲和层析柱Zn-Sepharose的纯化。其中融合重组人胸腺肽通过凝血因子Xa酶解制备单体。一种体外测量胸腺肽活性的方法，其特征在于胸腺细胞的提取，胸腺细胞凋亡的诱导和胸腺细胞凋亡的抑制。其中胸腺细胞的提取，其中胸腺细胞凋亡的诱导和抑制。一种激活T淋巴细胞的多肽的用途，其特征是权利要求1所述的重组人胸腺肽α1用于增强免疫和抗病毒的治疗，包括作为免疫损害患者的免疫增强剂，对乙型肝炎和丙型肝炎的治疗，对病毒性疾病的治疗等。本专利技术采用基因工程技术制备了重组人胸腺素α1(rhThyα1)，简便易行，大大降低了生产成本。同时，由于采用抗细胞凋亡的方法对其生物活性进行鉴定，缩短了活性鉴定的周期。经典的玫瑰花结法需要提取胸腺摘除一周小鼠的脾脏细胞，周期较长。而且观察玫瑰花结的形成数较为主观。本专利技术所述的方法则采用流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡，耗时较短，且较为客观。在本说明书中通过数字注明各参考文献，其全部罗列在实施例后。此中引用的参考文献均不能被解释为描述或暗示此中所公布的专利技术。附图说明图1为rhThyα1片段的PCR扩增图谱。其中，泳道1，PCR片段；泳道2，DNA标准。图2为重组质粒rhThyα1/pMD18-T的构建图谱。其中，泳道1，质粒；泳道2，DNA标准。图3为重组质粒rhThyα1/pET32b的酶切鉴定图谱。其中，泳道1，质粒；泳道2，DNA标准。图4为IPTG诱导融合蛋白Trx-rhThyα1的表达图谱。其中，泳道1，蛋白质标准；泳道2，未诱导的BL21(DE3)；泳道3，诱导的BL21(DE3)。图5为融合蛋白的酶解图谱。其中，泳道1，蛋白质标准；泳道2，酶切前的融合蛋白；泳道3，酶切后的融合蛋白。图6为Zn-Sepharose亲和层析与RP-HPLC图谱。其中，泳道1，蛋白质标准；泳道2，Trx-rhThyα1的酶解；泳道3，融合蛋白；泳道4，Trx；泳道5，经RP-HPLC提纯的rhThyα1；泳道6，标准rhThyα1。图7为rhThyα1的反向高效液相色谱洗脱图。图8为rhThyα1的质谱图。图9为rhThyα1的抗凋亡作用图谱。具体实施例方式本专利技术的材料1.菌株大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)，由申请人保存。2.质粒克隆质粒pMD18-T Vector购自TAKARA公司，表达质粒pET32b购自Novagen公司。3.酶和主要试剂rhThyα1模板(ATTGAGGGTCGCTCCGACGCTGCAGTTGACACCTCTTCCGAAATCACCACTAAAGACCTGAAAGAGAAAAAGGAAGTAGTTGAAGAGG CGGAAAACTAA)及PCR引物(5’引物GGTACCATTGAGGGTCGCTCCGACGCT)(3’引物GAGCTCTTAGTTTTCCGCCTCTTCAACTAC)由invitrogen公司合成；PCR试剂盒均为Promega公司产品；T4连接酶购自New England Biolab公司；限制性内切酶KpnI、SacI购自TAKARA公司；凝血因子Xa(FactorXa，FXa)购自Novagen公司；Thyα1标准品(ZADAXIN)购自SciClone公司；胸腺细胞凋亡诱导剂地塞米松(dexamethasone，Dex)购自南京第三制药厂。4.培养基的配制LB(1％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)，由申请人实验室配制。实施例1.PCR反应取1μL化学合成的rhThyα1模板(5nmol/L)加入36.75μL无菌水中，再依次加入50pmol 5’端引物和3’端引物，5μL 10×PCR缓冲液，1μL 10mmol/L dNTP，4μL 25mmol/L MgCl2以及0.25μL Taq酶，混匀后立即进行扩增。反应条件为94℃变性1min；然后进行以下26个循环94℃ 45s，54℃ 1min，72℃ 45s；再在72℃延伸8min。2.rhThyα1克隆质粒(Thyα1/pMD18-T Vector)的构建取4μL PCR扩增产物，与5μL连接缓冲液和1μL连接载体(含连接酶)混匀，置16℃保温30min。取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞，用KpnI/SacI双酶切筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定。3.rhThyα1表达质粒(Thyα1/pET32b)的构建将Thyα1/pMD-18T克隆质粒用KpnI/SacI双酶切，用琼脂糖凝胶电泳纯化回收酶切小片段(约100bp)，并与同样经过KpnI/SacI酶切的表达质粒pET32b连接。连接产物转化DH5α感受态细胞。用KpnI/SacI双酶切鉴定阳性克隆。4.rhThyα1融合蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人胸腺肽α↓［１］在大肠杆菌中的表达纯化和活性鉴定方法，其特征在于：在ＤＮＡ水平的重组人胸腺肽α↓［１］质粒的构建；目的基因在大肠杆菌系统中的表达；利用Ｚｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析柱对目标蛋白的纯化；以及使用胸腺细胞对重组人胸腺肽进行体外活性鉴定。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘建宁，孙自勇，陈均勇，张菁，吴盛，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]