一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、携带治疗基因腺病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、携带治疗基因的腺病毒及其制备方法和应用。所述腺病毒载体基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述腺病毒的基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、携带治疗基因的腺病毒及其制备方法和应用。所述腺病毒载体基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述腺病毒的基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。【专利说明】一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、携带治疗基因腺病毒及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、转录调控肿瘤靶向复制携带凋亡诱导和抗血管基因的溶瘤腺病毒及其制备方法及应用。
技术介绍
自1989年美国批准第一个临床试验至今，基因治疗获得了不断发展与进步。基因治疗在帕金森症，遗传性眼病上取得好疗效被2009年《科学》杂志评选为全球十大科学进展之一。截止到2007年，美国已有864个基因治疗和基因转染项目被批准进行临床试验，其中579项用于癌症治疗，3项已经进入III期临床试验。另外，445项临床试验在世界其他地方进行，大多数集中在欧洲(数据来源于Gene Therapy Clinical Trials Worldwide(GTCTff), http://www.abedia.com/wiley/index, html)。2012 年 Glybera 被欧洲药监局批准成为西方国家第一个基因药物治疗遗传病脂蛋白脂酶缺乏症(LPLD)，被称为是创新药物领域中的重要突破。腺病毒是迄今为止研究最透彻，应用最广泛的基因治疗载体，大概占基因治疗临床试验的23.3%(图1)。与其他载体比较，腺病毒有感染效率高，毒性小等优势。世界上第一个基因治疗药物今又生(Gendicine)被中国SFDA于2004年批准上市(复制缺陷腺病毒携带P53基因，国药准字S20 040004)，用于治疗头颈鳞癌。另一个产品HlOl (有限复制溶瘤腺病毒但Elb-55kda基因被敲除，商品名:安柯瑞，国药字S20060027)于2006年批准为肿瘤治疗药物。类似产品也在美国进行III期临床试验。目前中国申请临床试验的基因治疗产品26个，用于肿瘤治疗23个，其中4个已经进入III期临床试验(GTCTW)。虽然腺病毒基因治疗仍然需要克服机体免疫清除和增强效果的严峻考验，但是从目前的临床结果来看，这些产品安全性非常可靠，而且单纯应用或者联合放化疗应用的临床效果非常令人鼓多半O我国已经批准了两种腺病毒基因治疗产品在临床应用，同时还有很多产品正在进行临床试验。从发表的文献来看，国内大多数基因治疗产品的研发主要集中在治疗基因的发现与应用上，对靶向可控基因治疗载体研发和基因靶向导入及可调控表达技术研究较少。目前正在进行的临床试验中腺病毒产品主要以复制缺陷腺病毒为载体，或者应用已经批准的Ad-p53，或者安柯瑞(ONXY)病毒载体。美国德那翠丝有限公司2007年申请的用于癌症治疗的溶瘤腺病毒(申请号:200780009189.9)涉及用于治疗癌症的溶瘤腺病毒，其含有隔开启动子的人DNA序列，所述启动子赋予腺病毒基因以选择性表达。美国昂尼克斯药物公司1999年申请的用于治疗疾病的腺病毒载体(申请号:99805402.X)，将腺病毒载体E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点，或者其中含有的选择基因。上海三维生物技术有限公司申请的用于原发性肝癌基因治疗的腺病毒载体及使用方法(申请号03150897.9)，专利技术构建了一种基因重组腺病毒，其中含有甲胎蛋白启动子(AFP)基因和治疗基因。研究表明，该重组病毒可以特异性的杀伤表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞。郑州大学申请的靶向性溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用(200910066130.4)，该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，删除腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp_19K三个内在基因，保留E3B基因，保留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因，该载体可以插入任意一种有助于治疗肿瘤或用于感染性疾病疫苗的抗原基因。总之，目前我国拥有自主知识产权的用于腺病毒基因治疗的载体结构仍非常有限。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、转录调控肿瘤靶向复制携带凋亡诱导和抗血管基因的溶瘤腺病毒及其制备方法及应用。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为:所述转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体基因序列如SEQ ID N0.1所示。所述病毒载体是由pAdl020sf idACMV质粒、质粒pAd288和pBR304Ela穿梭质粒同源重组而成。所述基于上述载体的转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒的基因序列如SEQ IDN0.2所示。所述腺病毒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:(I)从人CEM细胞中提取人全基因组DNA，利用PCR扩增出HER2基因启动子片段；所述PCR中的扩增引物为:5’-GGGGGTCCTGG`AAGCCACAAG-3’ (SEQ ID N0.3),5’-CCGGAGAAACCAGGGGAG-3’ (SEQ ID N0.4)；所述HER2基因启动子片段的基因序列如SEQ ID N0.5所示；将HER2基因启动子片段与TA克隆载体联接后用XhoI和HindIII酶切后插入pGL3-basic载体中；(2)将CMV启动子插入到pAdl020sfidA穿梭质粒中构建成pAdl020sfidACMV，所述CMV启动子序列尾端建有多个限制性内切酶的序列，所述限制性内切酶序列如SEQ IDN0.6 ;将TRAIL-Endostatin融合基因通过XbaI和KpnI酶切插入pAdl020sf idACMV中形成pAdl020sf idACMVTRAIL-Endostatin 质粒；所述 TRAIL-Endostatin 融合基因序列如 SEQ IDN0.7所示；(3)将腺病毒5基因组中从Elb到E4的基因片段导入质粒pAd288中；所述Elb到E4的基因片段中E3gp-19kda基因和E4的l_4orf元件被敲除；所述E3gp_19kda基因序列如SEQ ID N0.8所示，E4的l_4orf元件基因序列如SEQ ID N0.9所示；(4)将Her2基因启动子片段从pGL3_basic载体中切出来，并插入到pBR304Ela穿梭质粒中构建成p304_Her2Ela ；(5)将步骤(2)至(4)构建的质粒用限制性内切酶sfil切开后进行同源性重组，即得到转录调控肿瘤靶向复制携带凋亡诱导和抗血管基因的溶瘤腺病毒。其中，步骤(3)中所述的从Elb到E4的基因片段依次包括Elb_19K，Elb_55k，IX，IVa2, Pol, pTP, 52K, pllla, III, pVII, PX, PVI, hexon, protease, DBP, 100K, 33K, 22K, pVIII,E3-12.5K,E3gp-19k, ADP:E3CRlbetaO, 10.5kda protein, E3RID_alpha, E3RID_beta, E3-14.7k，U exon, Fiber, E4orf6/7, E434k 基因;步骤(3)是先将 Elb_19k 基因(包括 TATA box和1672-3503)插入到pAd288载体构建成pAd288Elb ;然后以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李雄，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：