抗癌腺病毒制造技术

本文提供了抗癌腺病毒、其使用方法和制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗癌腺病毒相关申请的交叉引用本申请要求2010年8月16日提交的美国临时申请61/374,215的权益，所述临时申请为了所有目的全部并入本文。对联邦政府资助研发做出的专利技术的权利的声明本专利技术是在NationalInstitutesofHealth授予的政府支持CA137094下做出的。政府对本专利技术拥有某些权利。专利技术背景有52种人类腺病毒感染不同的人组织，还有上百种腺病毒能够感染从鱼到灵长动物的其他物种。这些病毒是高效的纳米级机器，能够在感染1小时内将它们的遗传物质有效负载至细胞核内。这些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以产生高滴度的病毒，而且它们在为了表达异位基因进行的研究和人类基因治疗应用中表现很安全。但是，到目前为止，由于使用几乎只限于一个变种Ad5或Ad2/5嵌合体以及不能快速和系统地构建和组合多个基因修饰，它们的潜在应用受到了局限。因此，需要将常用的腺病毒载体扩展到Ad2/5以外，并且要建立一个技术平台来协助由组成部分快速离体地组装新的腺病毒基因组，以便能够系统地引入多个修饰和异源元件。这样的系统可以利用天然的病毒架构在能够高效运送和表达36个基因(不包括剪接变体)方面的优点。所述系统可以提供有力的诊断剂和治疗剂，这些诊断剂和治疗剂包含对不同肿瘤样品中失去调控的途径活性的多重和定量测量。腺病毒载体在多种应用中的潜力受限于快速和系统地操纵36kb病毒基因组的能力。而且，基础研究、动物模型、基因治疗和溶瘤治疗中使用的腺病毒载体只限于腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad5居于最早发现的腺病毒之列，因此传统上有大量载体/工具来操纵它们的基因组，特别是E1区域。Ad2/5纤维蛋白(Fiberproteins)通过结合受体CAR感染上皮细胞。不幸的是，不是所有类型的细胞都表达CAR，而且在许多转移病例中被下调。再者，接近80%的人口具有预先存在的抗Ad2/5的中和抗体，这与脱靶肝摄取和炎症一起限制了它的系统性应用。因此，使用Ad2/5载体进行基因递送和癌症治疗不一定是最佳选择，相反主要是历史的偶然事件。我们的最终目的是建立强力的病毒癌症疗法，所述疗法不仅能够进行肿瘤选择性裂解复制，还可以在多轮治疗中进行系统地给药、避免对肝脏的毒性、有效地靶向和穿越令人苦恼的肿瘤血管、经由不同的受体感染细胞、在肿瘤内通过前药活化酶/毒素的局部表达产生肿瘤旁观者效应并且复苏有益的宿主抗病毒免疫反应。这些主要挑战又因为人类腺病毒不能在小鼠中复制而更加严重。这排除了相比异种移植模型有许多优势的在免疫活性癌症基因工程小鼠模型(GEMMs)中进行人溶瘤病毒评价的可以。52种人类腺病毒的存在表明腺病毒高度专性适应不同宿主组织环境中的感染和复制。这些病毒中有许多可以感染不同组织，并且具有与除CAR之外的细胞受体结合的纤维蛋白以及各不相同的“E3”免疫调节基因群。由于缺少修饰它们的基因组所需要的工具，对它们的这些独特属性还没有广泛的研究或利用。类似地，还存在感染其他物种的腺病毒，包括小鼠腺病毒(MAV-1)。本文提供了对现有技术中的这些和其他问题的解决方案。专利技术概述专利技术一方面提供了经过改造的腺病毒。所述经过改造的腺病毒可以是p53复制受损型腺病毒。p53复制受损型腺病毒处于p53表达细胞内时是复制受损的，但在p53受损型细胞内时不是复制受损的。专利技术另一方面提供了治疗癌症的方法。所述方法包括将有效量(例如治疗有效剂量或者用量)的经过改造的腺病毒(如上所述)或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸给予有此需要的受试对象。附图简述图1.腺病毒感染的原代或肿瘤细胞中E1B-55k的丢失或p53的降解诱导了p53水平，但对转录活性没有影响，这与ARF表达无关。a.用模拟物、野生型(wt)或ΔE1B-55k(Δ55k)病毒感染人原代小气道上皮细胞(SAECs)，并在感染后(hourspostinfection,h.p.i.)24、36和48小时收集。对蛋白裂解物进行归一化，并分析p53、p21、MDM2和ARF的表达情况。分析肌动蛋白的表达作为上样对照。b.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染U2OS细胞并在28h.p.i.固定。通过免疫荧光检测p53，用Hoechst染料将DNA复染。c.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染U2OS细胞，在24、36和48h.p.i.收集。多柔比星(Doxorubicin,dox)处理12小时作为p53激活的阳性对照。将蛋白裂解物归一化，并分析p53、p21和MDM2的表达。分析肌动蛋白的表达作为上样对照。d.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染带有异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导性ARF的U2OS稳定细胞系(NARF细胞)。细胞不做处理或者在8h.p.i.加入IPTG以诱导ARF的表达。利用实时PCR在36h.p.i.定量p21和MDM2的mRNA水平(下方小图)，作图表示为相对于(withrespectto,wrt)模拟物感染的细胞(-ARF)的倍数改变；竖线代表三个重复的标准差。还收集(48h.p.i.)了蛋白裂解物，归一化并分析p53、p21、MDM2和ARF的表达(上方小图)。肌动蛋白作为上样对照。图2.E1B-55k的缺失在感染腺病毒的细胞内诱发了高水平磷酸化p53，而p53转录靶被明显阻遏，不能被辐射、基因毒性药物、ARF、MDM2拮抗剂或者组蛋白去乙酰化酶抑制剂激活。a.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染U2OS细胞。样品在24h.p.i.用介质对照(-)或5-氟尿嘧啶(5-FU)处理。36h.p.i.收集蛋白裂解物，归一化并分析p53和p21的表达。分析肌动蛋白作为上样对照。b.用模拟物、Δ55k或wt病毒感染SAECs。细胞不做处理或者在31h.p.i.用10Gy进行γ-照射(IR)。在36h.p.i.收集蛋白裂解物(下方小图)，归一化并分析p53、p21和MDM2的表达。利用磷酸化特异性抗体检测p53在丝氨酸(ser)15处的磷酸化。肌动蛋白作为上样对照。还在36h.p.i.收集了总RNA，并通过实时PCR定量p53的转录靶(上方小图)。将PUMA、MDM2、p21、GADD45A和14-3-3σ的水平作图为相对于(wrt)未感染细胞在0小时的倍数改变；竖线代表三个重复的标准差。c.用模拟物或Δ55k病毒感染SAECs，并在36h.p.i.收集。多柔比星(dox)处理12小时作为p53活化的阳性对照。将蛋白裂解物归一化，并通过Western印迹分析总的p53和p21水平。利用p53磷酸化特异性抗体确定p53在ser6和9(酪蛋白激酶1)、ser15(ATM、ATR、DNA-PK)、ser20(CHK1、CHK2、JNK、MAPKAP2)、ser33(p38、PIN1)、ser46(HIPK2和DYRK2)、苏氨酸(thr)81(JNK、PIN1)、ser315(Aurora激酶、PIN1、CDK2和GSK-3)和ser392(PKR、CDK9和p38FACT-CK2)3的磷酸化。d.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染SAECs。样品在24h.p.i.用介质对照(-泳道)、多柔比星(dox)、MDM2拮抗剂、nutlin或曲古菌素(trichostatinA,TS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.16 US 61/374,2151.重组腺病毒在制备用于治疗由p53受损的细胞造成的癌症的药物中的用途，其中所述重组腺病毒是E1B-55k受损的和E4-ORF3受损的。2.如权利要求1所述的用途，其中所治疗的癌症的特征在于p53的表达或者活性降低。3.如权利要求1所述的用途，其中所述p53受损的细胞包含突变的p53基因。4.如权利要求1所述的用途，其中所述p53受损的细胞包含的基因组中p53基因被完全或者部分缺失。5.如权利要求1所述的用途，其中所述癌症是肺癌、皮肤癌或者乳腺癌。6.如权利要求1所述的用途，其中所述要治疗的癌症是恶化前乳腺癌。7.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：C奥谢，C鲍尔斯，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：
国别省市：