用于RNA分子高效重组的组合物和方法技术

本文提供了用于重构RNA分子的组合物和系统，包括使用这些分子的方法。例如，此类分子可用于通过两个或更多个病毒载体(例如AAV)递送蛋白质编码序列，从而在细胞中重构全长蛋白质。此类方法可用于递送治疗性蛋白质，例如以治疗遗传疾病或癌症。治疗遗传疾病或癌症。治疗遗传疾病或癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于RNA分子高效重组的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是2020年3月27日提交的PCT/US2020/025430的部分继续申请，该申请要求2019年11月11日提交的美国临时申请第62/933,714号的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。


[0003]本公开提供了能够重组两个或更多个RNA分子从而表达全长蛋白质的系统、试剂盒、组合物和方法。

技术介绍

[0004]基因疗法是治疗由功能丧失突变引起的遗传疾病有前途的方法。替代基因通常使用AAV等载体重新引入靶细胞中，因为病毒在进入细胞时通常是安全有效的。然而，在使用AAV的情况下，使用常规衣壳很难封装超过约5000个核苷酸。由于编码大型蛋白质的基因长度通常超过AAV的包装限制，因此许多遗传疾病仍然无法治疗。过去曾探索过克服这一限制的策略，但被证明效率低下，导致表达高水平潜在毒性截短蛋白，或两者兼而有之。因此，需要安全、高效的大型蛋白递送策略来治疗疾病。

技术实现思路

[0005]本文提供了用于表达靶蛋白的组合物。在一个实例中，所述组合物包括(a)第一RNA分子，所述RNA分子从5'至3'包含：(i)所述靶蛋白N
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端部分的编码序列；(ii)剪接供体；和(iii)第一二聚体化域；和(b)第二RNA分子，所述RNA分子从5'至3'包含：(i)第二二聚体化域，其中所述第二二聚体化域与所述第一二聚体化域结合；(ii)分支点序列；(iii)多嘧啶束；(iv)剪接受体；和(v)所述靶蛋白C<br/>‑
端部分的编码序列。
[0006]在一些实例中，所述第一和第二二聚体化域通过直接结合、间接结合或两种方式结合。
[0007]在一些实例中，所述二聚体化域是吻式环域或低多样性域。
[0008]在一些实例中，所述第一和/或第二RNA分子包含至少一个剪接增强子。
[0009]本文还提供了用于表达靶蛋白的组合物，包含：(a)第一合成DNA分子，编码权利要求1至16中任一项所述的第一RNA分子，其中所述第一合成DNA分子包含(i)第一启动子，其可操作连接至编码所述第一RNA分子的序列；(b)第二合成DNA分子，编码权利要求1至16中任一项所述的第二RNA分子，其中所述第二合成DNA分子包含(i)第二启动子，其可操作连接至编码所述第二RNA分子的序列。
[0010]本文还提供了用于表达靶蛋白的系统，包含所述组合物。
[0011]本文还提供了使用所公开的系统或由所述系统编码的RNA在细胞中表达蛋白质的方法。这种方法可以包括将所述系统引入细胞中，并在同一细胞中表达所述合成第一和第二RNA分子。在一些实例中，所述细胞在受试者中，并且所述方法治疗所述受试者的疾病，例
如由编码所述靶蛋白基因的突变引起的遗传疾病。在一些实例中，所述遗传病是杜氏肌营养不良症、A型血友病、斯塔加特病或亚瑟综合征。
[0012]参照附图，本公开的前述和其他目的及特征通过下列详细描述变得更加明显。
附图说明
[0013]专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。专利局将根据请求并经支付必要的费用提供本专利或专利申请出版物的彩色附图副本。
[0014]图1A示出了载体设计(左图)和RNA相互作用和剪接(右图)的示意图。左图：5'反式剪接(trsp)DNA载体：空心箭头是两个相反的启动子。RFP编码域和具有多聚腺苷酸化元件的3'UTR从YFP的N
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端部分(n
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yfp)相对表达，然后是剪接供体序列(SD)、下游内含子剪接增强子(DISE)和两个内含子剪接增强子(2xISE)、结合域(BD，也称为二聚体化域)和稳定的茎环BoxB元件(boxB)、自切割锤头状核酶(HHrz)，以包含多聚腺苷酸化元件的3'UTR结束。所述n
‑
yfp节段插入了小型内含子(n
‑
yfp内的白色节段)。3'trsp DNA载体：空心箭头是两个相反的启动子。BFP编码域和带有多聚腺苷酸化元件的3'UTR从互补结合域(抗
‑
BD，也称为二聚体化域)相反表达，随后是三个内含子剪接增强子序列(3xISE)、分支点(BP)、多嘧啶束(PPT)、剪接受体序列(SA)、所述YFP编码序列的C
‑
端质子，以含有多聚腺苷酸化元件的3'UTR结束。右图：显示了前体mRNA相互作用(5'trsp
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RNA+3'trsp
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RNA)和反式剪接以生成编码YFP蛋白的mRNA。
[0015]图1B示出了仅所述N
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端表达质粒的转染不会产生YFP荧光。
[0016]图1C示出了仅所述C
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端表达质粒的转染不会产生YFP荧光。
[0017]图1D示出了，无结合域的N
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端片段和C
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端片段的表达显示低水平的YFP诱导。
[0018]图1E示出了合理设计的环状构型的二聚体化/结合域(由互补序列间隔的所有嘧啶或所有嘌呤组成的低多样性序列，所述互补序列形成双链茎结构)。
[0019]图1F示出了“环状”二聚体化域构型的3D渲染。
[0020]图1G示出了在所述C
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端半段上没有结合域的阴性对照。
[0021]图1H示出了在所述N
‑
端半段上没有结合域的阴性对照。
[0022]图1I示出了，N
‑
端和C
‑
端半段上环状构型的匹配结合域在90％的细胞中显示出强YFP诱导。
[0023]图1J
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1N示出了结合域的构型数据(与图1E
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1I中数据等效)，从而产生完全开放的构型，所述结合域具有仅含嘧啶(或仅含嘌呤)序列组成的150个核苷酸低多样性序列。
[0024]图1J示出了150个核苷酸的低多样性嘧啶序列，从而产生互补碱基配对的完全开放构型。
[0025]图1K示出了(1J)的150个核苷酸低多样性嘧啶序列的3D渲染。
[0026]图1L示出了对照HEK293T细胞转染，其中所述C
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端
‑
YFP编码构建体缺乏互补的低多样性结合域。很少有转染细胞表达YFP。
[0027]图1M示出了对照HEK293T细胞转染，其中所述N
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端
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YFP编码构建体缺乏互补的低多样性结合域。很少有转染细胞表达YFP。
[0028]图1N示出了HEK293T细胞转染，其中N
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端
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YFP和C
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端
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YFP构建体都具有互补的低多样性二聚体化结合域。许多细胞高水平表达了YFP。
[0029]图1O示出了图1G中所示细胞的代表性荧光图像。表达了转染的阳性标志物(RFP+BFP)，但YFP蛋白没有有效重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于表达靶蛋白的组合物，包含(a)第一RNA分子，所述RNA分子从5'至3'包含：(i)所述靶蛋白N
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端部分的编码序列；(ii)剪接供体；和(iii)第一二聚体化域；和(b)第二RNA分子，所述RNA分子从5'至3'包含：(i)第二二聚体化域，其中所述第二二聚体化域与所述第一二聚体化域结合；(ii)分支点序列；(iii)多嘧啶束；(iv)剪接受体；(v)所述靶蛋白C
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端部分的编码序列。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一和第二二聚体化域通过直接结合、间接结合或其组合而结合。3.根据权利要求2所述的组合物，其中直接结合或间接结合包括碱基配对相互作用、非规范碱基配对相互作用、非碱基配对相互作用或其组合。4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中直接结合包括吻式环或低多样性区域之间的碱基配对相互作用。5.根据权利要求2或3所述的组合物，其中直接结合包括适体区域之间的非规范碱基配对相互作用、非规范碱基配对相互作用、非碱基配对相互作用或其组合。6.根据权利要求2或3所述的组合物，其中间接结合包括通过核酸桥的碱基配对相互作用。7.根据权利要求2所述的组合物，其中间接结合包括适体与适体靶标之间或两个适体之间的非碱基配对相互作用。8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述第一或第二二聚体化域不包含隐蔽剪接受体。9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述二聚体化域是直接结合或间接结合的适体序列二聚体化域。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述二聚体化域是吻式环相互作用域。11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中，所述靶蛋白是与疾病相关的蛋白质或治疗性蛋白质。12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述疾病是单基因疾病。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述治疗性蛋白质是毒素。14.根据权利要求11至13中任一项所述的组合物，其中所述疾病和所述靶蛋白是表1中列出的疾病和靶蛋白。15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述第一RNA分子还包含3'至所述剪接供体和5'至所述第一二聚体化域的下游内含子剪接增强子(DISE)、3'至所述剪接供体和5'至所述第一二聚体化域的内含子剪接增强子(ISE)中的一种或两种；和/或所述第二RNA分子还包含3'至所述第二二聚体化域和5'至所述分支点序列的ISE，以及3'至所述剪接供体和5'至所述二聚体化域的DISE中的一种或两种；或它们的任何组合。16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述第一RNA分子还包含位于3'至所述剪接供体任何位置的自切割RNA序列或RNA切割酶靶序列，因此其切割位于3'的多聚腺苷酸化尾以减少或抑制非重组RNA分子的蛋白质片段表达；
所述第二RNA分子还包含位于5'至所述分支点序列任何位置的自切割RNA序列或RNA切割酶靶序列，因此其切割位于5'的RNA帽以减少或抑制非重组RNA分子的蛋白质片段表达；所述第二RNA分子还包含5'至所述分支点序列任何位置的起始密码子，其相对于所述剪接受体的开放阅读框3'移位以减少或抑制从非重组RNA分子翻译靶蛋白片段；所述第一RNA分子还包含3'至所述剪接供体任何位置的微RNA靶位点，使得未连接的RNA片段一旦在细胞核外就进行微RNA依赖性降解；所述第二RNA分子还包含3'至所述编码序列任何位置的微RNA靶位点，使得未连接的RNA片段一旦在细胞核外就进行微RNA依赖性降解；所述第一RNA分子还包含3'至所述剪接供体任何位置的编码降解决定子蛋白降解标签的序列，使其与所述剪接供体位点的靶蛋白开放阅读框5'同框，从而使未连接的蛋白质片段标记为降解；所述第二RNA分子还包含起始密码子和5'至所述分支点序列任何位置的框内降解决定子蛋白降解标签，使得所述标签与所述剪接受体位点的靶蛋白开放阅读框3'同框，因此未连接的蛋白质片段标记为降解；或它们的任何组合。17.一种用于表达靶蛋白的组合物，包含：(a)第一合成DNA分子，编码权利要求1至16中任一项所述的第一RNA分子，其中所述第一合成DNA分子包含(i)第一启动子，其可操作连接至编码所述第一RNA分子的序列；和(b)第二合成DNA分子，编码权利要求1至16中任一项所述的第二RNA分子，其中所述第二合成DNA分子包含(i)第二启动子，其可操作连接至编码所述第二RNA分子的序列。18.根据权利要求17所述的组合物，其中每个启动子是独立选择的。19.根据权利要求18或19所述的组合物，其中：所述第一和第二启动子是相同启动子；或者所述第一和第二启动子是不同启动子。20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二启动子中的每一个独立地选自：组成型启动子；组织特异性启动子；和所述靶蛋白内源性的启动子。21.一种用于表达靶蛋白的系统，包含权利要求17至20中任一项的组合物。22.根据权利要求21所述的系统，其中当将所述系统引入细胞中时，产生所述RNA分子并以适当的顺序重组，从而产生所述靶蛋白的全长编码序列。23.根据权利要求21或22所述的系统，其中所述合成第一和第二RNA分子中的每一个从单独的病毒载体转录。24.根据权利要求21至23中任一项所述的系统，其中所述病毒载体是AAV。25.根据权利要求21至24中任一项所述的系统，其中所述合成DNA分子每一个的大小独立地选自：约2500nt至约5000nt、2,500nt至约2,750nt、约2,500nt至约3,000nt、约2,500nt至约3,250nt、约2,500nt至约3,500nt、约2,500nt至约3,750nt、约2,500nt至约4,000nt、约2,500nt至约4,250nt、约2,500nt至约4,500nt、约2,500nt至约4,750nt、约2,500nt至约5,000nt、约2,750nt至约3,000nt、约2,750nt至约3,250nt、约2,750nt至约3,500nt、约2,750nt至约3,750nt、约2,750nt至约4,000nt、约2,750nt至约4,250nt、约2,750nt至约4,500nt、约2,750nt至约4,750nt、约2,750nt至约5,000nt、约3,000nt至约3,250nt、约3,
000nt至约3,500nt、约3,000nt至约3,750nt、约3,000nt至约4,000nt、约3,000nt至约4,250nt、约3,000nt至约4,500nt、约3,000nt至约4,750nt、约3,000nt至约5,000nt、约3,250nt至约3,500nt、约3,250nt至约3,750nt、约3,250nt至约4,000nt、约3,250nt至约4,250nt、约3,250nt至约4,500nt、约3,250nt至约4,750nt、约3,250nt至约5,000nt、约3,500nt至约3,750nt、约3,500nt至约4,000nt、约3,500nt至约4,250nt、约3,500nt至约4,500nt、约3,500nt至约4,750nt、约3,500nt至约5,000nt、约3,750nt至约4,000nt、约3,750nt至约4,250nt、约3,750nt至约4,500nt、约3,750nt至约4,750nt、约3,750nt至约5,000nt、约4,000nt至约4,250nt、约4,000nt至约4,500nt、约4,000nt至约4,750nt、约4,000nt至约5,000nt、约4,250nt至约4,500nt、约4,250nt至约4,750nt、约4,250nt至约5,000nt、约4,500nt至约4,750nt、约4,500nt至约5,000nt、约4,750nt至约5,000nt、约2,500nt、约2,750nt、约3,000nt、约3,250nt、约3,500nt、约3,750nt、约4,000nt、约4,250nt、约4,500nt、约4,750nt和约5,000nt。26.根据权利要求21至25中任一项所述的系统，其中由所述系统的合成DNA分子编码的所述靶蛋白N
‑
端部分或所述靶蛋白C
‑
端部分的编码序列的大小各自独立地选自：约2500至4500nt、约2,500nt至约2,750nt、约2,500nt至约3,000nt、约2,500nt至约3,250nt、约2,500nt至约3,500nt、约2,500nt至约3,750nt、约2,500nt至约4,000nt、约2,500nt至约4,250nt、约2,500nt至约4,500nt、约2,750nt至约3,000nt、约2,750nt至约3,250nt、约2,750nt至约3,500nt、约2,750nt至约3,750nt、约2,750nt至约4,000nt、约2,750nt至约4,250nt、约2,750nt至约4,500nt、约3,000nt至约3,250nt、约3,000nt至约3,500nt、约3,000nt至约3,750nt、约3,000nt至约4,000nt、约3,000nt至约4,250nt、约3,000nt至约4,500nt、约3,250nt至约3,500nt、约3,250nt至约3,750nt、约3,250nt至约4,000nt、约3,250nt至约4,250nt、约3,250nt至约4,500nt、约3,500nt至约3,750nt、约3,500nt至约4,000nt、约3,500nt至约4,250nt、约3,500nt至约4,500nt、约3,750nt至约4,000nt、约3,750nt至约4,250nt、约3,750nt至约4,500nt、约4,000nt至约4,250nt、约4,000nt至约4,500nt、约4,250nt至约4,500nt、约2,500nt、约2,750nt、约3,000nt、约3,250nt、约3,500nt、约3,750nt、约4,000nt、约4,250nt和约4,500nt。27.根据权利要求21至26中任一项所述的系统，其中由所述系统的合成DNA分子编码的任一个或两个RNA分子的大小分别独立地选自：约2500至4500nt、约2,500nt至约2,750nt、约2,500nt至约3,000nt、约2,500nt至约3,250nt、约2,500nt至约3,500nt、约2,500nt至约3,750nt、约2,500nt至约4,000nt、约2,500nt至约4,250nt、约2,500nt至约4,500nt、约2,750nt至约3,000nt、约2,750nt至约3,250nt、约2,750nt至约3,500nt、约2,750nt至约3,750nt、约2,750nt至约4,000nt、约2,750nt至约4,250nt、约2,750nt至约4,500nt、约3,000nt至约3,250nt、约3,000nt至约3,500nt、约3,000nt至约3,750nt、约3,000nt至约4,000nt、约3,000nt至约4,250nt、约3,000nt至约4,500nt、约3,250nt至约3,500nt、约3,250nt至约3,750nt、约3,250nt至约4,000nt、约3,250nt至约4,250nt、约3,250nt至约4,500nt、约3,500nt至约3,750nt、约3,500nt至约4,000nt、约3,500nt至约4,250nt、约3,500nt至约4,500nt、约3,750nt至约4,000nt、约3,750nt至约4,250nt、约3,750nt至约4,500nt、约4,000nt至约4,250nt、约4,000nt至约4,500nt、约4,250nt至约4,500nt、约2,500nt、约2,750nt、约3,000nt、约3,250nt、约3,500nt、约3,750nt、约4,000nt、约4,250nt和
约4,500nt。28.根据权利要求21至27中任一项所述的系统，其中所述系统包含权利要求17至20中任一项所述的组合物：所述合成DNA分子的总大小选自约5000nt至约10,000nt、约5,000nt至约5,500nt、约5,000nt至约6,000nt、约5,000nt至约6,500nt、约5,000nt至约7,000nt、约5,000nt至约7,500nt、约5,000nt至约8,000nt、约5,000nt至约8,500nt、约5,000nt至约9,000nt、约5,000nt至约9,500nt、约5,000nt至约10,000nt、约5,500nt至约6,000nt、约5,500nt至约6,500nt、约5,500nt至约7,000nt、约5,500nt至约7,500nt、约5,500nt至约8,000nt、约5,500nt至约8,500nt、约5,500nt至约9,000nt、约5,500nt至约9,500nt、约5,500nt至约10,000nt、约6,000nt至约6,500nt、约6,000nt至约7,000nt、约6,000nt至约7,500nt、约6,000nt至约8,000nt、约6,000nt至约8,500nt、约6,000nt至约9,000nt、约6,000nt至约9,500nt、约6,000nt至约10,000nt、约6,500nt至约7,000nt、约6,500nt至约7,500nt、约6,500nt至约8,000nt、约6,500nt至约8,500nt、约6,500nt至约9,000nt、约6,500nt至约9,500nt、约6,500nt至约10,000nt、约7,000nt至约7,500nt、约7,000nt至约8,000nt、约7,000nt至约8,500nt、约7,000nt至约9,000nt、约7,000nt至约9,500nt、约7,000nt至约10,000nt、约7,500nt至约8,000nt、约7,500nt至约8,500nt、约7,500nt至约9,000nt、约7,500nt至约9,500nt、约7,500nt至约10,000nt、约8,000nt至约8,500nt、约8,000nt至约9,000nt、约8,000nt至约9,500nt、约8,000nt至约10,000nt、约8,500nt至约9,000nt、约8,500nt至约9,500nt、约8,500nt至约10,000nt、约9,000nt至约9,500nt、约9,000nt至约10,000nt、约9,500nt至约10,000nt、约5,000nt、约5,500nt、约6,000nt、约6,500nt、约7,000nt、约7,500nt、约8,000nt、约8,500nt、约9,000nt、约9,500nt和约10,000nt；所述总靶蛋白编码序列选自约2000nt至约8000nt、约2,000nt至约3,000nt、约2,000nt至约3,500nt、约2,000nt至约4,000nt、约2,000nt至约4,500nt、约2,000nt至约5,000nt、约2,000nt至约5,500nt、约2,000nt至约6,000nt、约2,000nt至约6,500nt、约2,000nt至约7,000nt、约2,000nt至约7,500nt、约2,000nt至约8,000nt、约3,000nt至约3,500nt、约3,000nt至约4,000nt、约3,000nt至约4,500nt、约3,000nt至约5,000nt、约3,000nt至约5,500nt、约3,000nt至约6,000nt、约3,000nt至约6,500nt、约3,000nt至约7,000nt、约3,000nt至约7,500nt、约3,000nt至约8,000nt、约3,500nt至约4,000nt、约3,500nt至约4,500nt、约3,500nt至约5,000nt、约3,500nt至约5,500nt、约3,500nt至约6,000nt、约3,500nt至约6,500nt、约3,500nt至约7,000nt、约3,500nt至约7,500nt、约3,500nt至约8,000nt、约4,000nt至约4,500nt、约4,000nt至约5,000nt、约4,000nt至约5,500nt、约4,000nt至约6,000nt、约4,000nt至约6,500nt、约4,000nt至约7,000nt、约4,000nt至约7,500nt、约4,000nt至约8,000nt、约4,500nt至约5,000nt、约4,500nt至约5,500nt、约4,500nt至约6,000nt、约4,500nt至约6,500nt、约4,500nt至约7,000nt、约4,500nt至约7,500nt、约4,500nt至约8,000nt、约5,000nt至约5,500nt、约5,000nt至约6,000nt、约5,000nt至约6,500nt、约5,000nt至约7,000nt、约5,000nt至约7,500nt、约5,000nt至约8,000nt、约5,500nt至约6,000nt、约5,500nt至约6,500nt、约5,500nt至约7,000nt、约5,500nt至约7,500nt、约5,500nt至约8,000nt、约6,000nt至约6,500nt、约6,000nt至约7,000nt、约6,000nt至约7,500nt、约6,000nt至约8,000nt、约6,500nt至约7,000nt、约6,
500nt至约7,500nt、约6,500nt至约8,000nt、约7,000nt至约7,500nt、约7,000nt至约8,000nt，或约7,500nt至约8,000nt，所述总靶蛋白编码序列为约2,000nt、约3,000nt、约3,500nt、约4,000nt、约4,500nt、约5,000nt、约5,500nt、约6,000nt、约6,500nt、约7,000nt、约7,500nt和约8,000nt；和/或由所述两个合成DNA分子编码的所述RNA分子的总大小选自约5,000nt至约9,000nt、约5,000nt至约5,500nt、约5,000nt至约6,000nt、约5,000nt至约6,500nt、约5,000nt至约7,000nt、约5,000nt至约7,500nt、约5,000nt至约8,000nt、约5,000nt至约8,500nt、约5,000nt至约9,000nt、约5,500nt至约6,000nt、约5,500nt至约6,500nt、约5,500nt至约7,000nt、约5,500nt至约7,500nt、约5,500nt至约8,000nt、约5,500nt至约8,500nt、约5,500nt至约9,000nt、约6,000nt至约6,500nt、约6,000nt至约7,000nt、约6,000nt至约7,500nt、约6,000nt至约8,000nt、约6,000nt至约8,500nt、约6,000nt至约9,000nt、约6,500nt至约7,000nt、约6,500nt至约7,500nt、约6,500nt至约8,000nt、约6,500nt至约8,500nt、约6,500nt至约9,000nt、约7,000nt至约7,500nt、约7,000nt至约8,000nt、约7,000...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：发明
国别省市：