对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达制造技术

本发明专利技术描述了包括外源开放阅读框(ORF)和自切割肽编码序列的重组腺病毒基因组。进一步公开了对病毒动力学影响最小的外源基因的最佳放置。还描述了所述重组腺病毒的治疗性应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达相关申请的交叉引用本申请要求2016年2月23日提交的美国临时申请No.62/298,653的权益，通过引用将其全部并入本文专利
本公开涉及在重组腺病毒构建体中外源开放阅读框的最佳放置以及该重组病毒的治疗性应用。
技术介绍
腺病毒血清型5(Ad5)是在基础研究应用、鼠肺癌模型和人类基因治疗试验中选择的载体。腺病毒具有稳定的36kb双链DNA基因组，其由Ad纤维蛋白刺突(spikes)装饰的蛋白衣壳保护，所述Ad纤维蛋白刺突(spikes)靶向感染特定细胞类型上的受体。腺病毒不整合到宿主DNA中，可以使用已建立的方案将其生产至高滴度，并且在人类基因治疗和癌症应用中已经证实安全性。因此，基于Ad的载体对癌症诊断和治疗具有巨大的希望。
技术实现思路
本文公开包括异源开放阅读框(ORF)和自切割肽编码序列的重组腺病毒基因组。所述异源ORF可编码，例如治疗性蛋白。由所述公开的基因组产生的所述重组腺病毒基因组和重组腺病毒可用于，例如治疗性应用，诸如用于癌症的治疗。本文提供重组腺病毒基因组，其包括异源ORF和自切割肽编码序列，两者均可操作地连接至与内源腺病毒ORF相同的阅读框中且在所述相同的阅读框中。所述自切割肽编码序列位于所述异源ORF和所述内源ORF之间。在一些实施方案中，所述内源ORF是E1B-55k且所述异源ORF在E1B-55k的3'；所述内源ORF是DNA聚合酶且所述异源ORF在DNA聚合酶的5'；所述内源ORF是DNA结合蛋白(DBP)且所述异源ORF在DBP的3'；所述内源ORF是腺病毒死亡蛋白(ADP)且所述异源ORF在ADP的5'；所述内源ORF是E3-14.7k且所述异源ORF在E3-14.7k的3'；所述内源ORF是E4-ORF2且所述异源ORF在E4-ORF2的5'；或者所述内源ORF是纤维蛋白且所述异源ORF在纤维蛋白的3'。在一些实例中，所述异源ORF编码治疗性蛋白。本文进一步提供包括本文公开的重组腺病毒基因组的重组腺病毒。还提供包括本文公开的重组腺病毒基因组或重组腺病毒和药学上可接受的载体的组合物。还提供通过向所述受试者施用本文公开的重组腺病毒基因组或重组腺病毒(或其组合物)将治疗性蛋白递送至受试者的方法。在这些方法中，所述重组腺病毒基因组的异源ORF或重组腺病毒的所述异源ORF编码所述治疗性蛋白。进一步提供了通过施用本文公开的重组腺病毒基因组或重组腺病毒(或其组合物)抑制肿瘤细胞活力、抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤进展、减小肿瘤体积以及治疗患有癌症的受试者的方法。在这些方法中，所述重组腺病毒基因组或重组腺病毒的所述异源ORF编码适合癌症治疗的治疗性蛋白。根据以下参照附图进行的详细描述，本公开的前述和其他客体和特征将变得更加明显。附图简要说明图1是用于测试腺病毒构建体的示例性工作流程的示意图。产生全病毒基因组质粒并将其转染到多孔板中合适的细胞中，例如293-E4细胞。当转染的细胞扩增(expand)，它们进行冷冻/解冻以释放病毒粒子，然后离心以沉淀细胞碎片。将上清液(含有所述病毒粒子)转移到多个、较大的培养板中。从转染的细胞中收获病毒粒子，CsCl纯化的(CsClpurified)和感染性病毒滴度通过ELISA测量。然后用纯化的病毒的已知的MOI感染感兴趣的细胞类型。在感染后48或72小时，分别通过Western印迹、q-PCR或噬斑试验来测量腺病毒晚期蛋白、腺病毒基因组或噬斑。图2是显示指数病毒生长的示意图。溶瘤杀死肿瘤内的所有细胞需要指数病毒生长。然而，在大多数情况下，最初仅感染小百分比的肿瘤细胞。因此，每轮复制的后代数量的小差异导致仅几轮复制后粒子总数的大差异。所示为每个循环产生3个病毒粒子的病毒与每个循环产生5个病毒粒子的病毒之间的比较。如图所示，在5-6轮复制后，两种病毒的病毒滴度显著不同。图3是显示基于荧光的病毒动力学(FBVK)测定的示例性工作流程的示意图。(例如通过Adsembly或AdSLIC)产生全病毒基因组质粒并将其用于转染多孔板中感兴趣的细胞类型。作为选择，用重组腺病毒粒子感染细胞。所述腺病毒基因组包括至少一个位于所述病毒基因组中编码荧光蛋白的开放阅读框(ORF)，其基本上不改变病毒复制动力学。随时间监测荧光以计算病毒复制动力学。溶瘤病毒候选物是在肿瘤细胞和正常细胞之间表现出最大的病毒动力学差异的那些。图4A-4B概述当用腺病毒基因组质粒开始时的动力学测定设置。该测定不需要准确知道最初的转染效率。选择转染条件以导致最初约5-10％的细胞被转染。在所示的实施例中，使用48孔板，其允许一式三份地测试14种不同的病毒构建体，连同三个模拟感染的孔和三个具有FluoresbriteTM珠子的孔以补偿工具灵敏度漂移。(图4A)所述48孔板的上半部分的孔含有用6种不同病毒的基因组质粒转染的细胞，模拟感染的细胞和空白(FluoresbriteTM珠子)，每种一式三份。(图4B)所述48孔板下半部分的孔含有用8种不同病毒的基因组质粒转染的细胞，一式三份。将所述多孔板置于读板仪(诸如TECAN读板仪)上以进行连续的荧光监测。图5概述当用重组病毒开始时的动力学测定设置。该测定不需要准确知道病毒滴度。将重组病毒连续稀释并将其用于感染铺在多孔板中的细胞。在所示的实例中，使用96孔板，每种病毒以1:100、1:300、1:900、1:2700、1:8100、1:24,300、1:72,900和1:218,700稀释，允许同时测试11种病毒。模拟感染四个孔并将FluoresbriteTM珠置于四个孔中以补偿工具灵敏度和漂移。将所述多孔板置于读板仪(例如TECAN读板仪)上以进行连续的荧光监测。图6A-6C提供用于组合装配重组腺病毒的Adsembly和AdSLIC技术的示意概览。(图6A)将所述腺病毒基因组分成四个模块-E1、核心、E3和E4。(图6B)Adsembly涉及使用多位点通道反应的基因组重新组装。(图6C)AdSLIC利用序列和非连接依赖性克隆(SLIC)来组装腺病毒模块。图7是显示在所述E1区中编码荧光蛋白的重组腺病毒的ln-斜率值的柱状图。显示直接融合构建体YPet-E1A，和YPet-P2A-E1A、E1A-P2A-mCherry和E1B-55k-P2A-YPet构建体的值，其各自含有P2A位点。显示所述YPet-P2A-ADP构建体用于比较。图8是基于荧光的病毒动力测定的动力学数据分析和解释的示意图。图9A-9C是显示来源于Ad5、Ad9或Ad34并含有在E3-14.7kORF(或其在Ad9和Ad34中的等同物)的3'的异源ORF的重组腺病毒的ln-斜率值的柱状图。显示的是Ad5(E3-14.7k-P2A-YPet；PCMN-887)、Ad9(E3-15k-P2A-YPet；PCMN-888)和Ad34(E3-14.8k-P2A-YPet；PCMN-889)在293细胞中(图9A)、A549细胞(图9B)和U2OS细胞(图9C)中的值。每个图中还显示了包括Ad5核心(其包括E3-14.7k-P2A-YPet)和来自Ad9(Ad5/Ad9)或Ad34(Ad5/Ad34)的纤维轴/球突(fibershaft/knob)的嵌合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组腺病毒基因组，包括异源开放阅读框(ORF)和自切割肽编码序列，两者均可操作地连接至与内源腺病毒ORF相同的阅读框中且在所述相同的阅读框中，其中所述自切割肽编码序列位于所述异源ORF和所述内源ORF之间，且其中：所述内源ORF是E1B‑55k且所述异源ORF在E1B‑55k的3'；所述内源ORF是DNA聚合酶且所述异源ORF在DNA聚合酶的5'；所述内源ORF是DNA结合蛋白(DBP)且所述异源ORF在DBP的3'；所述内源ORF是腺病毒死亡蛋白(ADP)且所述异源ORF在ADP的5'；所述内源ORF是E3‑14.7k且所述异源ORF在E3‑14.7k的3'；所述内源ORF是E4‑ORF2且所述异源ORF在E4‑ORF2的5'；或者所述内源ORF是纤维蛋白且所述异源ORF在纤维蛋白的3'；其中所述异源ORF编码治疗性蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.23 US 62/298,6531.重组腺病毒基因组，包括异源开放阅读框(ORF)和自切割肽编码序列，两者均可操作地连接至与内源腺病毒ORF相同的阅读框中且在所述相同的阅读框中，其中所述自切割肽编码序列位于所述异源ORF和所述内源ORF之间，且其中：所述内源ORF是E1B-55k且所述异源ORF在E1B-55k的3'；所述内源ORF是DNA聚合酶且所述异源ORF在DNA聚合酶的5'；所述内源ORF是DNA结合蛋白(DBP)且所述异源ORF在DBP的3'；所述内源ORF是腺病毒死亡蛋白(ADP)且所述异源ORF在ADP的5'；所述内源ORF是E3-14.7k且所述异源ORF在E3-14.7k的3'；所述内源ORF是E4-ORF2且所述异源ORF在E4-ORF2的5'；或者所述内源ORF是纤维蛋白且所述异源ORF在纤维蛋白的3'；其中所述异源ORF编码治疗性蛋白。2.如权利要求1所述的重组腺病毒基因组，其中所述治疗性蛋白包括免疫调节剂。3.如权利要求1或权利要求2所述的重组腺病毒基因组，其中所述自切割肽是2A肽或其变体。4.如权利要求3所述的重组腺病毒基因组，其中所述2A肽包括猪捷申病毒-1(PTV1)2A(P2A)肽、口蹄疫病毒(FMDV)2A(F2A)肽、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)肽或明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)2A(T2A)肽，或其变体。5.如权利要求4所述的重组腺病毒基因组，其中所述自切割肽的氨基酸序列与SEQIDNO:14-21中的任何一个的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致。6.如权利要求4所述的重组腺病毒基因组，其中所述自切割肽包括所述SEQIDNO:14-21中的任何一个的氨基酸序列。7.包括如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒基因组和药学上可接受的载体的组合物。8.包括如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒基因组的重组腺病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·欧谢伊，W·帕特洛，C·鲍尔斯，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：发明
国别省市：美国,US