RNA靶向方法和组合物技术

本公开提供了用于靶向RNA分子的CRISPR/Cas方法和组合物，其可以用于检测、编辑或修饰靶RNA。

RNA targeting method and composition

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA靶向方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求2017年8月22日提交的美国临时申请第62/548,846号、2017年10月16日提交的美国临时申请第62/572,963号、2018年3月6日提交的美国临时申请第62/639,178号和2018年3月27日提交的美国临时申请第15/937,699号的优先权，这些申请均通过引用全文结合入本文。
本公开涉及用于修饰(包括检测)RNA的CRISPR/Cas系统，其利用新的Cas13d蛋白质(也称作CasR和nCas1)和向导RNA。对政府资助的致谢本专利技术在美国国家卫生研究院(TheNationalInstitutesofHealth)授予的5DP5OD021369-02和5R21AG056811-02的政府资助下做出。美国政府对本专利技术拥有某些权利。
技术介绍
从微阵列(Schenaetal.,1995)到新一代测序和单细胞研究(Shendureetal.,2017)，过去20年来的技术进步已经转变了在细胞功能和疾病中转录组变化的作图(mapping)。但是，质询单个转录物动力学的功能以及在观察到的转录变化和细胞表型之间建立因果联系均要求积极控制或调节所需转录物的能力。DNA改造技术例如CRISPR-Cas9(DoudnaandCharpentier,2014；Hsuetal.,2014)使得研究者能够剖析特定遗传元件的功能或纠正致病突变。但是，研究和操纵RNA的简单且可扩展的工具显著落后于其DNA对应物。能够切割或抑制所需转录物的现有RNA干扰技术，具有明显的脱靶效应，并且由于其在内源性过程中的关键作用仍然是具有挑战性的改造靶标(Birminghametal.,2006；Jacksonetal.,2003)。因此，直接研究RNA功能作用的方法仍然有限。RNA改造中的关键限制之一是缺乏可以易于被重新靶向并引入到靶细胞中的RNA-结合结构域。例如，MS2RNA-结合结构域识别不变的21-核苷酸(nt)RNA序列(Peabody,1993)，因此要求进行基因组修饰，以标记所需的转录物。Pumilio同源性结构域具有模块化重复序列，其中每个蛋白质模块识别单独的RNA碱基，但是它们仅可以靶向短的8ntRNA序列(CheongandHall,2006)。尽管之前表征的II型(Batraetal.,2017；O'Connelletal.,2014)和VI型(Abudayyehetal.,2016；East-Seletskyetal.,2016)CRISPR-Cas系统可以被再编程，以识别20-30ntRNA，但是它们的大尺寸(～1200氨基酸,aa)使其难以包装到用于原代细胞和体内递送的AAV中。
技术实现思路
本申请提供原核生物基因组的生物信息学分析，以鉴定CRISPR-Cas重复序列阵列的序列特征，并挖掘之前未表征的可以用于RNA靶向工具的紧凑型Cas核糖核酸酶。改造的VI-D型CRISPR效应子可以用于有效地敲低(knockdown)人细胞中的内源性RNA，并操纵可变剪接，为RNA靶向应用以及进一步效应子结构域融合(作为转录组改造工具箱的部分)创造条件。本文提供靶向一种或多种靶RNA分子的方法，例如规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-相关的(Cas)系统-介导的RNA编辑方法。这些方法可以包括：使一种或多种靶RNA分子接触非天然(例如，在其引入的细胞或系统中并不天然地存在)或改造的CRISPR-Cas系统。这种CRISPR-Cas系统可以包括：(1)本文提供的至少一种Cas13d蛋白质或至少一种Cas13d核酸编码序列(例如编码所述至少一种Cas13d蛋白质的mRNA或载体)；和(2)至少一种与所述一种或多种靶RNA分子杂交的CRISPR-Cas系统向导核酸分子(例如向导RNA,gRNA)，或至少一种编码所述gRNA的核酸分子。Cas13d蛋白质与gRNA形成复合物，并且gRNA将该复合物引导至一种或多种靶RNA分子，并修饰(例如，切割、检测)所述一种或多种靶RNA分子。在一些实例中，一种或多种靶RNA分子(或含有一种或多种靶RNA分子的细胞)与包括至少一种Cas13d蛋白质和至少一种gRNA的复合物接触。在一些实例中，所述系统包括Mg2+。但是，在一些实例中，例如，如果不需要切割靶RNA，所述系统不包括Mg2+。在一些实例中，使一种或多种靶RNA分子与非天然或改造的CRISPR-Cas系统接触包括：例如，使用内吞作用、脂质体、颗粒、外来体、微泡、基因枪、电穿孔、病毒或其组合，向含有一种或多种靶RNA分子的细胞(例如真核细胞或原核细胞)中引入非天然或改造的CRISPR-Cas系统。在一些实例中，使一种或多种靶RNA分子与非天然或改造的CRISPR-Cas系统接触包括：使含有一种或多种靶RNA分子的无细胞系统(例如生物或环境样品，或细胞裂解物)与非天然或改造的CRISPR-Cas系统接触(例如，在检测靶RNA的诊断方法中)。在一些实例中，至少一种Cas13d蛋白质：(1)包括一个或多个HEPN结构域，(2)不大于150kD(例如，不大于140kD，不大于130kD，不大于120kD，例如大约90-120kD，大约100-120kD，或者大约110kD)，(3)包括一个或多个突变的HEPN结构域，并且可以加工向导RNA，但不能裂解或切割一个或多个靶RNA分子，(4)包括来自原核生物基因组或宏基因组(metagenome)、肠道宏基因组、活性污泥宏基因组(anactivatedsludgemetagenome)、厌氧消化池宏基因组(ananaerobicdigestermetagenome)、鸡肠道宏基因组、人肠道宏基因组、猪肠道宏基因组、牛肠道宏基因组、绵羊肠道宏基因组、山羊肠道宏基因组、水豚肠道宏基因组、灵长类肠道宏基因组、白蚁肠道宏基因组、粪便宏基因组、来自梭菌目(OrderClostridiales)或瘤胃菌科(FamilyRuminococcaceae)的基因组的Cas13d直向同源物，(5)包括来自白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、惰性真杆菌(Eubacteriumsiraeum)、黄化瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)XPD3002株、黄化瘤胃球菌FD-1、未培养的真杆菌属(Eubacteriumsp)TS28-c4095、未培养的瘤胃球菌属(Ruminococcussp.)、双环瘤胃球菌(Ruminococcusbicirculans)或瘤胃球菌属CAG57的Cas13d直向同源物，(6)包括与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向一种或多种RNA分子的方法，包括：/n使一种或多种靶RNA分子接触非天然或改造的规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-相关的(Cas)系统，所述系统包括：/n至少一种Cas13d蛋白质，或编码所述至少一种Cas13d蛋白质的核酸分子；和/n至少一种与所述一种或多种靶RNA分子杂交的CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)，或至少一种编码所述gRNA的核酸分子，/n从而所述Cas13d蛋白质与所述gRNA形成复合物，其中所述gRNA将所述复合物引导至所述一种或多种靶RNA分子，并且靶向所述一种或多种靶RNA分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170822 US 62/548,846;20171016 US 62/572,963;20181.靶向一种或多种RNA分子的方法，包括：
使一种或多种靶RNA分子接触非天然或改造的规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-相关的(Cas)系统，所述系统包括：
至少一种Cas13d蛋白质，或编码所述至少一种Cas13d蛋白质的核酸分子；和
至少一种与所述一种或多种靶RNA分子杂交的CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)，或至少一种编码所述gRNA的核酸分子，
从而所述Cas13d蛋白质与所述gRNA形成复合物，其中所述gRNA将所述复合物引导至所述一种或多种靶RNA分子，并且靶向所述一种或多种靶RNA分子。


2.CRISPR-Cas系统介导的RNA靶向方法，包括：
使一种或多种靶RNA分子接触非天然或改造的规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-相关的(Cas)系统，所述系统包括：
至少一种Cas13d蛋白质，或编码所述至少一种Cas13d蛋白质的核酸分子；和
至少一种与所述一种或多种靶RNA分子杂交的CRISPR-Cas系统gRNA，或至少一种编码所述gRNA的核酸分子，
从而所述Cas13d蛋白质与所述gRNA形成复合物，其中所述gRNA将所述复合物引导至所述一种或多种靶RNA分子，并且靶向所述一种或多种靶RNA分子。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使所述一种或多种靶RNA分子接触非天然或改造的CRISPR-Cas系统包括向含有所述一种或多种靶RNA分子的细胞中引入所述非天然或改造的CRISPR-Cas系统。


4.根据权利要求3所述的方法，其中使用内吞作用、脂质体、颗粒、外来体、微泡、基因枪、电穿孔、病毒或其组合将所述CRISPR-Cas系统引入到所述细胞中。


5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶RNA分子或所述细胞与包括所述至少一种Cas13d蛋白质和所述至少一种CRISPR-Cas系统gRNA的复合物接触。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述至少一种Cas13d蛋白质：
包括一个或多个HEPN结构域，
不大于150kD，不大于140kd，不大于130kD，不大于120kD，例如大约90-120kD，大约100-120kD，或者大约110kD，
包括一个或多个突变的HEPN结构域，并且可以加工所述向导RNA，但不能切割所述一个或多个靶RNA分子，
包括来自原核生物基因组或宏基因组、肠道宏基因组、活性污泥宏基因组、厌氧消化池宏基因组、鸡肠道宏基因组、人肠道宏基因组、猪肠道宏基因组、牛肠道宏基因组、绵羊肠道宏基因组、山羊肠道宏基因组、水豚肠道宏基因组、灵长类肠道宏基因组、白蚁肠道宏基因组、粪便宏基因组、来自梭菌目或瘤胃菌科的基因组的Cas13d直向同源物，
包括来自白色瘤胃球菌、惰性真杆菌、黄化瘤胃球菌XPD3002株、黄化瘤胃球菌FD-1、未培养的真杆菌属TS28-c4095、未培养的瘤胃球菌属、双环瘤胃球菌或瘤胃球菌属CAG57的Cas13d直向同源物，
包括与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295或296至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；
包括SEQIDNO:195、196或197所示的基序，
包括SEQIDNO:288、289、290或291所示的共有序列，
包括一个或多个氨基酸缺失，
包括一个或多个氨基酸插入，
被分成2个或更多个可以在共递送时重构全长功能酶的片段，
被修饰成不同Cas13d直向同源物的嵌合体，
被截短至少1％，例如1-10％，
任选地进一步包括一个或多个亚细胞定位信号、效应子结构域、纯化标签、亲和标签，或
其组合。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中编码所述至少一种Cas13d蛋白质的核酸分子包括：
至少一个Cas13d蛋白质编码序列，其经密码子优化以在真核细胞中表达；
至少一个Cas13d蛋白质编码序列，其经密码子优化以在原核细胞中表达；
至少一个Cas13d蛋白质编码序列，其经密码子优化以在人细胞中表达，并且包括与SEQIDNO:114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144或145至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；
至少一个Cas13d蛋白质编码序列，其包括与SEQIDNO:124、125、126、127、128、139、140或141至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；
至少一个Cas13d蛋白质编码序列，其编码包括与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295或296至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白质；
至少一个来自原核生物基因组或宏基因组的Cas13d直向同源物；或
至少一个来自肠道宏基因组、活性污泥宏基因组、厌氧消化池宏基因组、鸡肠道宏基因组、人肠道宏基因组、猪肠道宏基因组、牛肠道宏基因组、绵羊肠道宏基因组、山羊肠道宏基因组、水豚肠道宏基因组、灵长类肠道宏基因组、白蚁肠道宏基因组、粪便宏基因组、来自梭菌目或瘤胃菌科的基因组的Cas13d直向同源物。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中编码所述至少一种Cas13d蛋白质的核酸分子包括与所述至少一个Cas13d蛋白质编码序列可操作连接的启动子，并且任选地是载体的部分。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中与所述一种或多种靶RNA分子杂交的gRNA包括：
成熟gRNA，
pre-gRNA，
一个或多个全长或截短的同向重复(DR)序列，
一个或多个间隔子序列，
一个或多个包括DR-间隔子-DR-间隔子的序列，
一个或多个DR序列，其包括与SEQIDNO:129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252或254至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，
任选地，插入到gRNA中的核酸适配体，
或其组合。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中靶向一种或多种靶RNA分子包括以下的一种或多种：切割所述一种或多种靶RNA分子，使所述一种或多种靶RNA分子产生切口，激活所述一种或多种靶RNA分子，使所述一种或多种靶RNA分子失活，可视化或检测所述一种或多种靶RNA分子，标记所述一种或多种靶RNA分子，结合所述一种或多种靶RNA分子，富集所述一种或多种靶RNA分子，耗尽所述一种或多种靶RNA分子，编辑所述一种或多种靶RNA分子，运输所述一种或多种靶RNA分子，剪接所述一种或多种靶RNA分子或扰乱所述一种或多种靶RNA分子的剪接，和掩蔽所述一种或多种靶RNA分子。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中修饰所述一种或多种靶RNA分子包括以下的一种或多种：
RNA碱基置换，
RNA碱基缺失，
RNA碱基插入，
靶RNA中的断裂，
排...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·D·徐，S·康纳曼，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：发明
国别省市：美国;US