腺病毒组装方法技术

本文提供了组装改良腺病毒的方法、腺病毒基因模块文库和它们的组合物。

Adenovirus assembly method

Methods for assembling improved adenoviruses, adenovirus gene module libraries, and compositions thereof are provided.

【技术实现步骤摘要】
腺病毒组装方法本专利技术是基于申请日为2011年8月16日，申请号为“201180050029.5”(国际申请号为PCT/US2011/048006)，专利技术名称为“腺病毒组装方法”的专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2010年8月16日提交的美国临时申请61/374,198的权益，为了所有目的，该临时申请全部并入本文。专利技术背景有52种人类腺病毒感染不同的人组织，还有上百种腺病毒能够感染从鱼到灵长动物的其他物种。这些病毒是高效的纳米级机器，能够在感染1小时内将它们的遗传物质有效负载至细胞核内。这些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以产生高滴度的病毒，而且它们在为了表达异常基因进行的研究和人类基因治疗应用中表现很安全。但是，到目前为止，由于使用几乎只限于一个变种Ad5或Ad2/5嵌合体以及不能快速和系统地构建和组合多个基因修饰，它们的潜在应用受到了局限。因此，需要将常用的腺病毒载体扩展到Ad2/5以外，并且要建立一个技术平台来协助由组成部分快速离体地组装新的腺病毒基因组，以便能够系统地引入多个修饰和异源元件。这样的系统可以利用天然的病毒架构在能够高效运送和表达36个基因(不包括剪接变体)方面的优点。所述系统可以提供有力的诊断剂和治疗剂，这些诊断剂和治疗剂包含对不同肿瘤样品中失去调控的途径活性的多重和定量测量。腺病毒载体在多种应用中的潜力受限于快速和系统地操纵36kb病毒基因组的能力。而且，基础研究、动物模型、基因治疗和溶瘤治疗中使用的腺病毒载体只限于腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad5居于最早发现的腺病毒之列，因此传统上有大量载体/工具来操纵它们的基因组，特别是E1区域。Ad2/5纤维蛋白(Fiberproteins)通过结合受体CAR感染上皮细胞。不幸的是，不是所有类型的细胞都表达CAR，而且CAR在许多转移病例中被下调。再我们的最终目的是建立强力的癌症病毒疗法，所述疗法不仅能够进行肿瘤选择性裂解复制，还可以在多轮治疗中进行系统地给药、避免对肝脏的毒性、有效地靶向和穿越令人苦恼的肿瘤血管、经由不同的受体感染细胞、在肿瘤内通过前药活化酶/毒素的局部表达产生肿瘤旁观者效应并且复苏有益的宿主抗病毒免疫反应。这些主要挑战因为人类腺病毒不能在小鼠中复制而更加严重。这排除了相比异种移植模型有许多优势的在免疫活性癌症基因工程小鼠模型(GEMMs)中进行人溶瘤病毒评价的可能。52种人类腺病毒的存在表明腺病毒高度专性适应不同宿主组织环境中的感染和复制。这些病毒中的许多可以感染不同组织，并且含有能够结合除CAR之外的细胞受体的纤维蛋白以及一群不同的‘E3’免疫调节基因。由于缺少修饰它们的基因组所需要的工具，对它们的这些独特属性还没有广泛的研究或利用。类似地，还存在感染其他物种的腺病毒，包括鼠腺病毒(MAV-1)。本文提供了对现有技术中的这些和其他问题的解决方案。专利技术概述本专利技术一方面提供了制备重组腺病毒的方法(文中又称为“Adsembly”)。所述方法包括由两个或更多个腺病毒基因模块组装核酸，所述模块选自E1模块、E2-L2模块、L3-L4模块、E3模块、E4模块或者腺病毒大模块(macromodule)(或者如下文描述的突变体)。本专利技术另一方面提供了包含复数个腺病毒基因模块的文库。本专利技术另一方面提供了实施本文提供的方法的试剂盒。附图简述图1.现有腺病毒载体方法和Adsembly的比较列表。Adsembly克服了现有系统中的多个限制。图2.进一步开发腺病毒作为治疗剂所需要克服的挑战。简图表明了该领域需要克服的几个主要问题。图3.列举了四种不同腺病毒属的系统发生树。没有列出所有已知腺病毒。该图展示了腺病毒家族中的种类多样性。图4.52种已知的人腺病毒的受体和向性。受体和向性在血清型和亚型之间有所不同，因此可以利用这一点来重新靶向某些病毒。图5.腺病毒各属中保守的“核心”基因组区。顶端的图是人Ad5基因组(SEQIDNo:137)的简化图谱，其中的核心区以虚线框强调。正如下端图中围绕基因的白框表明的，该核心区在所有腺病毒属中保守。所有属都含有该核心区，并且几乎全部的核心开放读框都是从IVa2(左端)到pVIII(右端)。基因组的多变性存在于基因组的末端。申请人将我们的模块名称划分为E1模块(文中又称为E1样模块)(条带指示的核心区左侧的全部)、核心模块(条带指示的)和E3模块(文中又称为E3样模块)(条带指示的核心区右侧的全部)，因为模块内容在不同腺病毒种类之间会有所变化，但它们相对核心区的位置不会变。一些情况中，纤维(fiber)紧挨着核心区，而在其他(人Ads)中位于核心区之外。图6.多种腺病毒属的转录图谱，显示了腺病毒种类之间的保守转录单位。显示了核心基因，以及在一或两个属中可以看到的基因。该图可以看出不同属之间基因组末端的多样性。这里引用的"Davison,Benko,Harrach"是指Metal.,(2005)FamilyAdenoviridae.FauquetCM,MayoMA,ManiloffJ,DesselbergerU,BallLA(eds):VirusTaxonomy.VIIIthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses.Elsevier,NewYorkpp213-228。图7A-7C.SEQIDNO:32给出的人Ad5聚合酶蛋白中氨基酸966-1103(底端，紧靠共有序列的上方)与来自非人腺病毒的多个聚合酶蛋白中的相应区域的比对。每个非人Ad序列在与该Ad5聚合酶序列进行分别比较时，该区域内至少45％相同。左侧的记号表示GenBank登录号，从上到下分别对应SEQIDNO:1-32。图7D-7G.SEQIDNO:73给出的人Ad5六邻体蛋白(hexonprotein)中氨基酸501-747(底端，紧靠共有序列的上方)与来自非人腺病毒的多个六邻体蛋白中的相应区域的比对。每个非人Ad序列在与Ad5六邻体序列进行分别比较时，该区域内至少45％相同。左侧的记号表示GenBank登录号，从上到下分别对应SEQIDNO:33-73。图7H-7I.SEQIDNO:103给出的人Ad5DNA结合蛋白中氨基酸408-475(底端，紧靠共有序列的上方)与来自非人腺病毒的多个DBPs中的相应区域的比对。每个非人Ad序列在与Ad5DBP序列进行分别比较时，该区域内至少35％相同。以黄色标识的残基在各物种之间是100％保守的。左侧的记号表示GenBank登录号，从上到下分别对应SEQIDNO:74-103。图7J.SEQIDNO:135给出的人Ad5pVIII蛋白中氨基酸6-43(底端，紧靠共有序列的上方)与来自非人腺病毒的多个pVIII蛋白中的相应区域的比对。每个非人Ad序列在与Ad5pVIII序列进行分别比较时，该区域内至少35％相同。左侧的记号表示GenBank登录号，从上到下分别对应SEQIDNO:104-135。图8.腺病毒基因组操作的初始概念一览。图9.利用四个DNA片段进行的多位点gateway的简单示意图。多位点gateway是我们提议的用于重新组装基因组的系统。左侧是提议的系统。图10A.详细说明g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备重组腺病毒的方法，包括：通过不依赖序列和连接反应的克隆法(SLIC)合并可杂交腺病毒目标载体骨架与一个或多个可杂交腺病毒基因模块来组装腺病毒基因组，其中所述的一个或多个可杂交腺病毒基因模块包含E2‑L2模块、L3‑L4模块、E2‑L4模块、E1模块、E3模块、E4模块，或其组合。

【技术特征摘要】
2010.08.16 US 61/374,1981.一种制备重组腺病毒的方法，包括：通过不依赖序列和连接反应的克隆法(SLIC)合并可杂交腺病毒目标载体骨架与一个或多个可杂交腺病毒基因模块来组装腺病毒基因组，其中所述的一个或多个可杂交腺病毒基因模块包含E2-L2模块、L3-L4模块、E2-L4模块、E1模块、E3模块、E4模块，或其组合。2.权利要求1的方法，其中所述的可杂交腺病毒目标载体骨架为腺病毒核心模块目标载体以及一个或多个可杂交腺病毒基因模块，其中所述的腺病毒核心模块目标载体包含E2-L2模块、L3-L4模块、E2-L2模块和L3-L4模块两者、或E2-L4；其中所述的一个或多个可重组的腺病毒基因模块包含E1模块，E3模块，E4模块，或其任意组合。3.权利要求1或2的方法，其中所述的可杂交目标载体骨架包含p15A复制原点。4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的可杂交目标载体骨架包含I-SceI哺乳动物表达盒。5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述的核心模块至少长12kb。6.权利要求2-4任一项的方法，其中所述的核心模块至少长14kb。7.权利要求2-6任一项的方法，其中所述的核心目标模块包含E2-L2模块和L3-L4模块。8.权利要求2-6任一项的方法，其中所述的核心模块包含E2-L...

【专利技术属性】
技术研发人员：C奥谢，C鲍尔斯，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：发明
国别省市：美国,US