包含外源抗原的人巨细胞病毒制造技术

公开了包含异源抗原的人巨细胞病毒载体。来源于TR毒株的载体是更昔洛韦敏感的，包含活性US2、US3、US6、US7和UL131A基因，并且在UL82基因中具有阻止pp71表达的有害或失活突变。

Human cytomegalovirus comprising an exogenous antigen

Human cytomegalovirus vectors comprising heterologous antigens are disclosed. Vectors derived from TR strains are ganciclovir sensitive and contain active US2, US3, US6, US7, and UL131A genes and have deleterious or inactivating mutations in the UL82 gene that prevent the expression of pp71.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含外源抗原的人巨细胞病毒相关申请的交叉引用本申请要求于2014年7月16日提交的题为HUMANCYTOMEGALOVIRUSCOMPRIZINGEXOGENOUSANTIGENS的美国临时申请No.62/025,348的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
总体来说，所述领域涉及疫苗平台。更具体地，所述领域涉及表达外源抗原的重组人巨细胞病毒载体。
技术介绍
动物实验已经证明，载有巨细胞病毒(CMV)的疫苗是独特的，因为它们：a)诱导并维持高频率的超淋巴样T细胞(extralymphoidTcell)应答(所谓的效应记忆性T细胞)；b)超感染CMV阳性宿主；以及c)即使当宿主向宿主(host-to-host)扩散缺陷时仍保持免疫原性。此外，动物模型中的实验已经表明，来源于动物CMV的疫苗载体诱导针对感染性疾病和癌症的保护性免疫应答(US20080199493；US20100142823；US20130136768和US20140141038；所有这些通过引用并入本文)。特别引人注目的是以下发现：载有恒河猴CMV(RhCMV)的猴免疫缺陷病毒(S1V)疫苗不仅能够预防非人灵长类动物中的AIDS，而且能够最终治愈这些动物的SIV(HansenSG等，Nature502，100-104(2013)；通过引用并入本文)。在巨细胞病毒疫苗的开发中使用减毒株(attenuatedstrain)是重要的，因为未弱化的毒株可以从宿主向宿主扩散，并且至少在免疫受损个体中可能是病理性的。之前，弱化的人CMV(HCMV)毒株未能a)建立潜伏感染(PlotkinSA和HuangES，JInfectDis152，395-397(1985)；通过引用并入本文)；b)诱导长持续时间的免疫力(JacobsonMA等，JClinVirol35，332-337(2006)；通过引用并入本文)；c)再次感染显著比例的之前已被CMV天然感染过的群体(HeinemanTC等，JInfectDis193，1350-1360(2006)，通过引用并入本文)；或d)产生持续感染(WO2013/036465，通过引用并入本文)。此外，当在成纤维细胞中生长时，HCMV基因组的临床毒株在体外高度不稳定，导致成纤维细胞适应(adaptation)，例如UL131A的缺失。这样的适应对组织培养物在体内执行载体功能能力的影响大多是未知的。除了需要弱化以在体外和体内稳定之外，重要的是这些载体可以被制造为具有可重现的结果。最稳定的弱化策略是基因缺失。然而，这通常需要产生互补细胞系(complementingcellline)，这对用于生长巨细胞病毒的原代细胞来说是难以实现的。
技术实现思路
本文公开了来自HCMV-TR3的严重弱化、扩散缺陷(即，细胞向细胞扩散缺陷)的载体，HCMV-TR3是HCMVTR毒株的遗传修饰形式。所公开的载体建立并维持持续感染，诱导并维持针对异源抗原的效应记忆T细胞，并再次感染CMV血清阳性宿主。所述载体包含异源抗原，例如非CMV病原体特异性抗原或肿瘤抗原。特别地，将TR3工程化为更昔洛韦敏感的。在一个实例中，这是由于添加了活性UL97基因(其在TR3的原始临床分离株中突变)。将TR3进一步工程化以包含活性US2、US3、US6和US7基因，这些基因在TR3的原始临床分离株的BAC克隆期间被移除。TR3的另外的形式包括编码pp71之UL82基因中的有害(即失活)突变，其在本文中可以称为TR3Δpp71或另称为TR3ΔUL82。在载体的另一些实例中，编码异源抗原的基因的表达可以由UL82启动子或另一种病毒启动子如UL7、UL38、UL45或US13启动子驱动。在另一些实例中，可以插入编码异源抗原的多个基因来代替UL82和另一种病毒基因如UL7、UL38、UL45或US13，以使得病毒基因启动子驱动异源抗原基因的表达。本文还公开了产生缺少功能性pp71蛋白(由UL82基因编码)的HCMV的方法。所述方法涉及用缺少功能性pp71蛋白的HCMV感染细胞，其中所述细胞包含使DAXX基因沉默的siRNA。在另一些实施方案中，所述方法涉及用缺少功能性pp71蛋白的HCMV感染细胞，其中通过本领域已知的其他技术使细胞中DAXX基因的表达在蛋白质或RNA水平下调，例如通过RNA干扰(如微小RNA打靶和短发夹RNA(shRNA)打靶)、核酶切割、通过条件或诱导型启动子调节的表达、DAXX结合蛋白的表达，或靶向用于泛素化和降解的DAXX或DAXX蛋白复合物。使用这些方法，有效地产生HCMV而不需要互补。细胞可以是任何细胞，包括人成纤维细胞。附图说明本文中的一些附图在以彩色呈现时更好理解，这在专利申请公开中不可用。然而，申请人认为彩色附图是原始公开的一部分，并且保留在后面的程序中呈现本文附图的彩色版本的权利。图1A和1B共同显示，与其他HCMV毒株相比，HCMVTR在建立潜伏期和从潜伏期再活化(+G-CSF)方面更优越。图1A是在图1B中使用的HCMV克隆的基因组结构的图。HCMV基因组的侧翼是使长独特序列(uniquelong，UL)区和短独特序列(uniqueshort，US)区分离的末端重复(TRL和TRS，如所示)和内部重复(IRS)。每个构建体中BAC盒的位置由标识为B的区域指示。由于BAC盒的插入，HCMVTR的US区域缺少US2-7。除缺少US2-7外，TRΔ4缺少基因UL128-UL150。UL131A基因在AD169中缺陷，但在AD169BADUL131A中被修复(Wang和Schenk，2005，下文)。Toledo具有UL133-128区域的倒置，在UL128中具有缺失(Murphy等，2003下文)。图1B是总结了植入有人CD34+干细胞并用指定HCMV毒株感染的人成纤维细胞腹膜内接种的NOD/SCID/IL2Rγ-null(NSG)小鼠的结果的图。感染后4周，通过粒细胞集落刺激因子(G-CSF)处理动员人造血干细胞，并通过定量PCR在肝中测量病毒载量。图2是HCMV-TR3基因组的图示，其示出了针对存在于原始HCMVTR毒株中的开放阅读框(ORF)的变化。为了赋予更昔洛韦敏感性，将HCMVTR的UL97替代为HCMVAD169的UL97。BAC盒侧翼为loxP位点，并且在cre介导的自切除后，单个loxP位点保留在基因组中。由于HCMV-TRBAC缺少US2-7，插入来自HCMVAD169的相应基因。示出了末端(ab和c′a)重复和内部重复(b′a′c)。图3是显示HCMV-TR3对更昔洛韦(GCV)敏感而HCMV-TR则对更昔洛韦(GCV)不敏感的图。用HCMVTR3、HCMVTB40E和原始HCMVTR(MOI为1PFU/细胞)感染生长停滞的人胎儿成纤维细胞MRC-5细胞或模拟感染。如果指出，在感染后90分钟用增加浓度的GCV处理细胞，直到在未处理的对照中观察到广泛的病毒细胞病变效应(感染后4天)。然后通过MRC-5细胞上的标准噬斑减少测定来测定细胞培养物上清液的感染性。将噬斑的数目作为药物浓度的函数作图，并测定IC50。值是两次独立测定的平均值。图4A和4B显示，HCMV-TR3出人意料地维持感染内皮细胞的能力并在多本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组人巨细胞病毒(HCMV)，其包含：(1)至少一种异源抗原；(2)UL82基因中的失活突变；和(3)活性US2、US3、US6、US7和UL131A基因；其中所述重组HCMV来源于HCMV的TR毒株；并且其中所述重组HCMV是更昔洛韦敏感的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.16 US 62/025,3481.重组人巨细胞病毒(HCMV)，其包含：(1)至少一种异源抗原；(2)UL82基因中的失活突变；和(3)活性US2、US3、US6、US7和UL131A基因；其中所述重组HCMV来源于HCMV的TR毒株；并且其中所述重组HCMV是更昔洛韦敏感的。2.权利要求1的重组HCMV，其还包含活性UL97基因。3.权利要求1或2的重组HCMV，其中所述活性US2、US3、US6和US7基因来源于HCMV的AD169毒株。4.权利要求1至3中任一项的重组HCMV，其中所述至少一种异源抗原的表达由UL82启动子、UL7启动子、UL45启动子、UL78启动子或US13启动子驱动。5.权利要求1至4中任一项的重组HCMV，其中UL82基因中的失活突变是UL82基因的全部或部分缺失。6.权利要求5的重组HCMV，其中所述至少一种异源抗原替代UL82基因的全部或部分。7.权利要求6的重组HCMV，其中替代UL82基因的全部或部分的所述至少一种异源抗原的表达由UL82启动子驱动。8.权利要求1至7中任一项的重组HCMV，其还包含选自以下的HCMV基因中的失活突变：UL7、UL38、UL45和US13。9.权利要求8的重组HCMV，其中UL7基因中的失活突变是UL7基因的全部或部分缺失。10.权利要求9的重组HCMV，其中所述至少一种异源抗原替代UL7基因的全部或部分。11.权利要求10的重组HCMV，其中替代UL7基因的全部或部分的所述至少一种异源抗原的表达由UL7启动子驱动。12.权利要求8的重组HCMV，其中UL38基因中的失活突变是UL38基因的全部或部分缺失。13.权利要求12的重组HCMV，其中所述至少一种异源抗原替代UL38基因的全部或部分。14.权利要求13的重组HCMV，其中替代UL38基因的全部或部分的所述至少一种异源抗原的表达由UL38启动子驱动。15.权利要求8的重组HCMV，其中UL45基因中的失活突变是UL45基因的全部或部分缺失。16.权利要求15的重组HCMV，其中所述至少一种异源抗原替代UL45基因的全部或部分。17.权利要求16的重组HCMV，其中替代UL45基因的全部或部分的所述至少一种异源抗原的表达由UL45启动子驱动。18.权利要求8的重组HCMV，其中US13基因中的失活突变是US13基因的全部或部分缺失。19.权利要求18的重组HCMV，其中所述至少一种异源抗原替代US13基因的全部或部分。20.权利要求19的重组HCMV，其中替代US13基因的全部或部分的所述至少一种异源抗原的表达由US13启动子驱动。21.权利要求1至20中任一项的重组HCMV，其还包含UL128基因或UL130基因中的失活突变。22.权利要求21的重组HCMV，其中所述重组HCMV包含UL128基因和UL130基因中的失活突变。23.权利要求1至22中任一项的重组HCMV，其中所述至少一种异源抗原是病原体特异性抗原或肿瘤抗原。24.权利要求1至23中任一项的重组HCMV，其中编码所述重组HCMV基因组和所述至少一种异源抗原的核酸序列在通过成纤维细胞多次传代时是稳定的。25.权利要求1至23中任一项的重组HCMV，其还包含第二异源抗原。26.权利要求25的重组HCMV，其中所述第一异源抗原替代UL82基因的全部或部分，并且其中所述第二异源抗原替代选自UL7、UL45、UL...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳斯·弗吕，斯克特·G·汉森，杰伊·纳尔逊，路易斯·皮克，帕特里齐亚·卡波西奥，
申请(专利权)人：俄勒冈健康与科学大学，
类型：发明
国别省市：美国,US