一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV‑1毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV‑1毒株，基因组中编码逆转录酶是蛋白质序列为SEQ ID NO:4所示的蛋白质；基因组中编码逆转录酶的基因是DNA序列为SEQ ID NO:3所示的DNA分子。本发明专利技术将野生型HIV病毒的基因组中编码逆转录酶自N末端第181位氨基酸残基的密码子由酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子、第188位氨基酸残基的密码子由酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子得到的重组病毒。本发明专利技术构建的毒株对奈拉伟平具有良好的耐药性，该毒株对奈拉伟平的半数抑制浓度(IC50)＞0.06127μM，具有传代稳定性，可应用于抗艾滋病药物的筛选，对于抗HIV药物的筛选具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】
一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株及其制备方法和应用
本专利技术属于生物基因工程领域，具体涉及一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株及其制备方法和应用。
技术介绍
人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)的病原体，自1981年美国首次诊断出艾滋病以来，艾滋病在全球范围内迅速传播，截至2015年11月，我国累计报告艾滋病病毒(HIV)感染者和AIDS病人580409例。HIV基因组由两条相同的正链RNA组成，每条RNA长约9.2-9.8kb，包括如下9个基因：(1)gag基因(编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17，P24、P7、P6等核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏)；(2)pol基因(编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需)；(3)env基因(编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，并切割形成gp120和gp41)；(4)tat基因(编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译)；(5)rev基因(产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白)；(6)nef基因(编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用)；(7)vif基因(可以介导机体细胞内的天然抗病毒蛋白APOBEC3G的降解，影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播)；(8)vpu基因(为HIV-1所特有，可以介导机体细胞内的天然抗病毒蛋白Tetherin的降解，为HIV的有效复制所必需)；(9)vpr基因(编码蛋白是一种弱的转录激活物，具有致凋亡和细胞周期改变功能，在病毒体内繁殖周期中起一定作用)。1996年高效抗反转录病毒联合治疗(HAART)的出现和应用成为艾滋病(AIDS)抗病毒治疗史上具有里程碑意义的重大事件。临床观察表明，抗病毒治疗对减轻病情、提高病人生活质量、延长生命具有很好的作用。目前已经应用于临床的药物包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、整合酶抑制剂和CCR5受体拮抗剂六类。非核苷类逆转录酶抑制剂包括奈韦拉平(Nevirapine,NVP)、依非韦伦(Efavirdine,EFV)、地拉韦定(Delavirdine)依曲伟林(Etravirine)、英特莱(Intelence)、利匹韦林(Ripivirine)等。目前，我国常用的非核苷类抑制剂主要是NVP和EFV。NVP一般作为药代动力学增强剂，与其他药物配伍，提高血药浓度，减少单一突变对药物活性的影响。非核苷类逆转录酶抑制剂NVP适合儿童，成人等，是一线抗病毒治疗的主要药物，但是不能单独使用。目前全国接受抗病毒治疗的人数有471140人，其中接近1/3的治疗人群使用NVP。我国从2003年开始在全国范围内逐步实施免费的艾滋病抗病毒治疗，现免费提供的抗艾滋病药物有七种，包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂三类。NVP是其中免费提供的非核苷类逆转录酶抑制剂。我国2012年发布的第三版《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》对于成人和青少年的艾滋病患者推荐的治疗方案包括奈拉伟平。由于合成工艺比较困难，以及药物的结构等问题。中国对非核苷类抑制剂的仿制相对落后，我国面临必须填补非核苷类抑制剂生产空白的现状，为HIV感染者提供更多的抗病毒治疗选择。根据新药研发的有关规定，新型抗HIV药物上市前必须评价其耐药性，即使用非核苷类抑制剂耐药的HIV毒株检测其抗病毒效果，再进行临床观察。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株及其制备方法和应用，本专利技术构建的毒株具有良好的耐药性和传代稳定性，可应用于抗HIV药物的筛选。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株，基因组中编码逆转录酶是蛋白质序列为SEQIDNO:4所示的蛋白质；基因组中编码逆转录酶的基因是DNA序列为SEQIDNO:3所示的DNA分子。一种上所述对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株的制备方法，将野生型HIV病毒的基因组中编码逆转录酶自N末端第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子、第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子得到DNA序列如SEQIDNO:3所示的DNA分子；再将该DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到重组质粒；最后将重组质粒导入离体的哺乳动物细胞并培养制得。上述将第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子的方法是将野生型HIV病毒的基因组中编码逆转录酶的基因的开放阅读框自5’末端第542位核苷酸的碱基A突变为G。上述将第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子的方法是将野生型HIV病毒的基因组中编码逆转录酶的基因的开放阅读框自5’末端第563位核苷酸的碱基A突变为G。上述哺乳动物细胞为293T细胞。上述哺乳动物细胞的培养方法是在将哺乳动物细胞在37℃下培养18-48h。上述野生型HIV病毒为野生型的HIV-1B亚型病毒。上述野生型的HIV-1B亚型病毒具体为野生型的HIV-189.6病毒。上述的对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株在筛选抗HIV病毒的药物中的应用。相比于现有技术，本专利技术的优势在于：本专利技术提供一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株及其制备方法和应用，是将野生型HIV病毒的基因组中编码逆转录酶自N末端第181位氨基酸残基的密码子由酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子、第188位氨基酸残基的密码子由酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子得到的重组病毒。本专利技术构建的毒株对奈拉伟平(NVP)具有良好的耐药性，该毒株对奈拉伟平(NVP)的半数抑制浓度(IC50)＞2048μM，具有传代稳定性，可以体外模拟病人由于使用此逆转录酶抑制剂所产生的耐药性，可应用于抗艾滋病药物的筛选，对于抗HIV药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。附图说明图1为本专利技术的耐药毒株的逆转录酶DNA人工序列。图2为本专利技术的耐药毒株的逆转录酶蛋白质人工序列。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株，其基因组中编码逆转录酶是蛋白质序列为SEQIDNO:4所示的蛋白质；基因组中编码逆转录酶的基因是DNA序列为SEQIDNO:3所示的DNA分子。一种上所述对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株的制备方法，如图1和2所示，将野生型的HIV-189.6病毒的基因组中编码逆转录酶自N末端第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸(Y)的密码子突变为半胱氨酸(C)的密码子、第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸(Y)的密码子突变为半胱氨酸(C)的密码子得到DNA序列如SEQIDNO:3所示的DNA分子；再将该DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到重组质粒；最后将重组质粒导入离体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV‑1毒株，其特征在于：基因组中编码逆转录酶是蛋白质序列为SEQ ID NO:4所示的蛋白质；基因组中编码逆转录酶的基因是DNA序列为SEQ ID NO:3所示的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株，其特征在于：基因组中编码逆转录酶是蛋白质序列为SEQIDNO:4所示的蛋白质；基因组中编码逆转录酶的基因是DNA序列为SEQIDNO:3所示的DNA分子。2.一种权利要求1所述对逆转录酶抑制剂耐药的HIV-1毒株的制备方法，其特征在于：将野生型HIV病毒的基因组中编码逆转录酶自N末端第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子、第188位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子得到DNA序列如SEQIDNO:3所示的DNA分子；再将该DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到重组质粒；最后将重组质粒导入离体的哺乳动物细胞并培养制得。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述将第181位氨基酸残基的密码子从酪氨酸的密码子突变为半胱氨酸的密码子的方法是将野生型HIV病毒的基因组中编码逆转录酶的基因的开放阅读框自5’末端第5...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁冰玉，梁浩，周波，叶力，蒋俊俊，陈荣凤，潘沛江，黄颉刚，宁传艺，廖艳研，刘洁，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45