检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。具体而言，本发明专利技术公开了检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，包括检测逆转录酶基因M41L突变的探针、检测逆转录酶基因A62V突变的探针、检测逆转录酶基因K65R突变的探针、检测逆转录酶基因D67N突变的探针、检测逆转录酶基因69INS插入突变的探针、检测逆转录酶基因K70R突变的探针、检测逆转录酶基因L74V突变的探针、检测逆转录酶基因V75I突变的探针、检测逆转录酶基因F77L突变的探针、检测逆转录酶基因Y115F突变的探针、检测逆转录酶基因F116Y突变的探针等等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测Hiv-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。
技术介绍
一、核苷和核苷类似物类药物作用机制:人类免疫缺陷病毒(HIV)属于逆转录病毒，又分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染，现有药物主要是抑制HIV-1型病毒的复制。自从1995年开始应用新的抗病毒治疗方案，即联合使用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的HAART以来，HIV感染的临床进程被大大改变。这些药物通过阻断病毒复制使得免疫系统重建其CD4+T细胞库并恢复对病原体的免疫力，明显降低了 HIV/AIDS相关疾病的发病率和病死率。截至目前，美国FDA已经批准了 4大类共26种抗病毒药物用于艾滋病的临床治疗，其中包括核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,nRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)、蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor，PI)和融合抑制剂(fusion inhibitors)。我国已有5种国产抗病毒药物进入临床。在HIV-1的复制循环中，逆转录酶在完成RNA指导的DNA合成、RNA水解反应和DNA指导的DNA合成过程中起着十分重要的作用。因此，HIV-1逆转录酶是抗HIV/AIDS药物设计的一个重要生物靶点。目前市场上出现的以HIV-1逆转录酶为靶点的药物按作用机制和化学结构可分为核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂。核苷类逆转录酶抑制剂是最先问世、开发品种较多的一类药物，临床证实对HIV复制具有很强的抑制作用，核 苷类逆转录酶抑制剂(nRTIs)，是HIV病毒逆转录酶作用底物脱氧核苷酸的类似物，在体内转化成活性的三磷酸核苷衍生物，与天然的三磷酸脱氧核苷竞争性与HIV逆转录酶(reverse transcriptase, RT)结合,抑制RT的作用，阻碍前病毒的合成。已上市的nRTIs药物有:齐多夫定、去轻肌苷、扎西他滨(DDC)、司坦夫定、拉米夫定、阿巴卡韦等。nRTIs的结构与核苷类似，为双脱氧核苷衍生物，可与细胞内核苷竞争性地结合逆转录酶，从而终止逆转录反应。通过阻断病毒RNA基因的逆转录，即阻断病毒的双股DNA的形成，使病毒失去复制的模板。此类药物首先进入被感染的细胞，然后磷酸化形成具有活性的双脱氧核苷三磷酸化合物，竞争性抑制艾滋病病毒逆转录酶，可导致未成熟的DNA链合成终结，从而病毒复制受到抑制。早期用于治疗AIDS及其相关综合征，对治疗HIV阳性/AIDS有一定的效果，可降低死亡率及机会性感染率，但不能治愈AIDS。研究表明，核苷类逆转录酶抑制剂联用，副作用大，易出现交叉耐药。二、HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂的耐药类型及机制:随着我国免费艾滋病抗病毒治疗的开展，HIV-1病毒耐药性的监测越来越受到重视。HIV-1病毒耐药性的产生取决于两方面:病毒复制过程中的高频突变和抗病毒药物产生的选择压力。HIV-1是RNA病毒，其基因组由单链RNA转变为RNA-DNA复合物，进而反向转录为前病毒DNA,再由前病毒转录为病毒基因组RNA,整个过程均由病毒自身的RT催化。因其RT缺乏核酸外切酶活性，对转录错误无校正功能，所以转录的忠实性差，转录中的碱基错配常导致基因突变，因此HIV-1病毒复制过程中表现出很高的突变频率，每个碱基对在每轮复制中发生突变的频率约为3.4X 10_5。另一方面，HIV-1病毒复制迅速，感染初期每天可新形成IO9 101°病毒颗粒。HIV-1病毒的高速复制及复制过程中的高频突变，导致原发感染的几个月内就可形成非常大量的基因突变病毒。一旦突变发生在逆转录酶和蛋白酶的编码基因序列，就有可能引起逆转录酶和蛋白酶分子发生改变，导致HIV-1病毒对作用于这两种酶的抑制剂不再敏感，产生耐药性。开始抗病毒治疗后，野生型病毒被显著抑制，临床上可见到病毒载量明显下降，如果药物对病毒抑制不完全，与耐药有关的突变型仍可以持续复制。在药物产生的选择压力下，耐药突变型最终取代野生病毒株成为优势群体，临床上可表现为病毒载量的反弹。核苷和核苷类似物通过抑制RT终止病毒DNA的合成。HIV对这些药物的耐药涉及2种不同机制，即破坏这些类似物与DNA结合以及将其从过早终止的DNA链末端移除。RT的多种变异或组合变异可通过选择性破坏RT而具有将类似物结合到DNA的能力，导致耐药产生。主要包括M184V变异、Q151M变异复合体以及K65R变异。M184V、非胸苷类似物突变如K65R和L74V、多核苷耐药突变Q151M复合体是通过减少nRTI整合至DNA的机制产生耐药；脱氧胸腺嘧啶核苷类似物突变(TAMs)、与多核苷耐药相关的T69插入以及许多辅助突变是通过促使nRTIs从DNA水解而产生耐药。M184V变异即在RT第184位的甲硫氨酸被缬氨酸取代，该变异也是导致病毒对拉米夫定耐药的主要变异。Q151M复合体在HIV-1中相对较少(在所有对核苷类似物耐药的HIV-1中所占比例小于5%)，但可导致对大部分而非全部(如拉米夫定和替诺福韦)类似物的耐药。RT的一组变异可导致核苷类似物从DNA链末端被移除，促使对所有核苷和核苷酸类似物的耐药，其中包括替诺福韦。此类变异是逐渐出现的，且出现的顺序也是多变的。TAMs突变可分为两条通路: 一条与T215Y突变有关(包括M41L、L210W、T215Y和EA4D)，称为 TAMs-1 ;另一类与 T215F 突变有关(包括 D67N、K70R、T215F 和 K219Q)，称为 TAMs-1I。研究认为，在TAMs-1通路中，最初出现的突变是T215Y，随后是M41L和L210W，之后再在此基础上逐级积累1-3个其他突变密码子。至于TAMs-1I通路，很多研究认为K70R突变通常是逆转录酶在AZT治疗过程中最先出现的基因突变。三、Hiv-1病毒的耐药检测方法:在高效抗逆转录病毒联合疗法(highlyactive antiretroviral therapy,HAART)治疗中，病毒变异使得治疗的敏感性下降，常常导致治疗失败。一些研究显示，耐药与抗逆转录病毒治疗无效密切相关，对HIV-1耐药株进行监测以指导临床用药及预防耐药株的迅速上升和扩散日显其重要性。目前已有数项研究表明，对病人进行耐药性检测具有重要临床应用价值，因而国际艾滋病学会(International AIDS Society-USA)、欧洲AIDS临床学会(European AIDSClinical Society, EAcs)等几个专家组,在其AIDS治疗指南当中推荐使用HIV耐药检测。耐药成为AIDS治疗面临的严峻挑战，同时耐药性检测逐渐成为帮助临床医生选择联合用药方案的重要工具。目前HIV-1病毒耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的方法有直接测序法、异源双链轨迹试验(ΗΤΑ)、PCR连续酶测定试验、线性探针试验、限制性内切酶酶切试验、引物特异的PCR测定、本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是：包括以下16类特异性探针中的至少一类：检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:1~9中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:10~17中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:18~23中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:24~29中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:30~39中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:40~45中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:46~51中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:52~57中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:58~63中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:64~69中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:70~75中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:76~81中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因M184V和M184I突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:82~90中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:91~96中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因T215Y和T215F突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:97~105中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因K219Q和K219E突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:106~116中的任意一种或任意一种的互补序列。...

【技术特征摘要】
1.检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是:包括以下16类特异性探针中的至少一类: 检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 1、中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 1(Γ 7中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 18 23中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 24 29中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 30 39中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针，为SEQ ID NO:40 45中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 46 51中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 52 57中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 58 63中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针，为SEQ ID Ν0:64 69中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 70 75中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 76 81中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因M184V和Μ184Ι突变的特异性探针，为SEQ ID NO:82 90中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针，为SEQ ID NO:91 96中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因Τ215Υ和T215F突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 97 105中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因K219Q和Κ219Ε突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 106 116中的任意一种或任意一种的互补序列。2.根据权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是: 所述检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 1 3中的任意一种为针对第41位氨基酸残基为M的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 4、中的任意一种为针对第41位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因；所述检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 1(Γ 2中的任意一种为针对第62位氨基酸残基为A的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 13^17中的任意一种为针对第62位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 18 20中的任意一种为针对第65位氨基酸残基为K的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ23中的任意一种为针对第65位氨基酸残基为R的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 24 26中的任意一种为针对第67位氨基酸残基为D的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 27 29中的任意一种为针对第67位氨基酸残基为N的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针中，SEQ ID ΝΟ:3(Γ32中的任意一种为针对第69位氨基酸残基为T的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 33 39中的任意一种为针对在第69位氨基酸残基T后插入SSS、SSA或SSG的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针中，SEQ ID ΝΟ:4(Γ42中的任意一种为针对第70位氨基酸残基为K的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:43^45中的任意一种为针对第70位氨基酸残基为R的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针中，SEQ ID N0:46 48中的任意一种为针对第74位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:49^51中的任意一种为针对第74位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 52 54中的任意一种为针对第75位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 55 57中的任意一种为针对第75位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录 酶基因； 所述检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 58 60中的任意一种为针对第77位氨基酸残基为F的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID ΝΟ:6Γ63中的任意一种为针对第77位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针中，SEQ ID Ν0:64 66中的任意一种为针对第115位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一种为针对第115位氨基酸残基为F的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针中，S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琼，李兰娟，项春生，吴南屏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：