检测HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变法及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。本发明专利技术具体公开了检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，包括以下8类特异性探针中的至少一类：检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y188L?、Y188H和Y188C突变的特异性探针、检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针、检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测Hiv-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。
技术介绍
一、非核苷类逆转录酶抑制剂及其作用机制获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS),又称艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原体为HIV-1病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)，HIV属于逆转录病毒，分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。HIV-1极易产生基因变异，在药物选择压力下形成了大量突变株，使临床应用的抗HIV药物迅速丧失临床效价，对目前的抗HIV治疗构成了严重的威胁。最早获准上市的抗HIV药物是祀向逆转录酶(Reverse transcriptase, RT)的核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleoside RT inhibitors, nRTIs),但是该类药物具有严重的毒副作用。之后上市的非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside RT inhibitors, NNRTIs)具有高效低毒的优点，是目前高效抗逆转录疗法(Highly active antiretroviral therapy, HAART)的重要组成部分。NNRTIs与核苷类化合物不同，其糖环部分为开链结构，因为缺少5’-位羟基，不能进行磷酰化，不参与DNA合成，它们和RT相互作用的机制不同于nRTIs，而是通过与HIV-1RT的非底物结合部位结合，间接影响非底物结合部位的构型，产生抑制活性。HIV-1 RT是由p66/p51亚基组成的异 二聚体酶，其中，p51亚基没有催化活性，仅具有构象调节作用。p66亚基由聚合酶活性域及RNase H活性域组成，聚合酶活性域由手指、手掌、拇指及链接4个亚结构域构成，其功能是以单链的病毒RNA为模板将三磷酸脱氧核苷(dNTP)有序地连接起来合成双链DNA。NNRTI是非竞争抑制剂，它与位于RT酶p66亚基手掌亚结构域上的结合位点(NNRTIs binding pocket,NNIBP)的结合引起的RT构象变化,破坏了 DNA聚合酶催化位点的精确结合构象，尤其是β2-β3片层上高度保守的Y183-M184-D185-D186基序。此夕卜，NNRTI的结合扭曲了组成“引物沟”结构元件的活性构象，干扰引物DNA链的精确定位，进而抑制DNA的聚合反应。近年来，为克服nRTIs临床长期应用而引发的毒副作用，非核苷类化合物在治疗HIV-1方面得到迅速发展，如奈维雷平、地拉韦定和依非韦仑。二、HIV-1病毒对非核苷类逆转录酶抑制剂的耐药类型及机制NNRTIs长期临床应用也会产生耐药性，极大地限制了其临床应用。进一步研究表明，不同结构类型的NNRTIs所致HIV变异株各不相同，如双杂芳环呱嗪类化合物表现为HIV-1 RT第100位氨基酸变异产生抗药性，TIBO类则使其103位氨基酸变异，TSAO类又表现为138位氨基酸变异产生抗药性，双吡啶类会引起第106位氨基酸发生变化，吡啶酮类抗药部位在181位。而HEPT类化合物的耐药株病毒主要表现在第100位的亮氨酸变异为异亮氨酸，103位的赖氨酸变异为天门冬氨酸，106位的缬氨酸变异为组氨酸。NNRTIs在临床使用时，NNIBP中单个氨基酸的突变直接影响药物的结合，经自然选择后，迅速出现耐药毒株。主要的NNRTI耐药突变有K103N/S、V106A/M、Y181C/L/V、Y188L/C/H 和 G190A/S/E ;次要的 NNRTI 耐药突变有 L1001、K101P、P225H、F227L、M230L和K238T，常常与I个主要NNRTI耐药突变联合出现。对第一代NNRTI耐药的变异株包括L1001、K103N、V106A、E138K、Y188I/C和Y188H,这些变异都位于NNIBP的内部或者周围。例如:(I)与NVP耐药性有关的Y181C、G190A和K103N突变;(2)与EFV耐药性有关的K103N突变；(3)与DLV突变有关的Y181C和K103N突变。此外，其他突变如T215Y/F、M41L、L210W、H208Y和Vl 181等也会使NNRTI产生耐药。其中，K103N、Y181C和G190A/S是最为严重的变异株，能使绝大多数NNRTI产生严重耐药。另外，NNRTI之间也普遍存在交叉耐药性。通过对大量RT/NNRTI复合物的X衍射晶体学研究，并结合临床及生物化学相关数据，发现HIV-1变异株对NNRTI产生耐药性的分子机制包括以下三种:(a)氨基酸突变使RT/NNRTI之间关键性疏水性作用缺失或改变；(b)氨基酸突变产生对RT/NNRTI结合不利的立体位阻；(c)氨基酸变异引起的结合位点电荷分布及氢键作用的改变。Y181或Y188突变成非芳香性的疏水氨基酸(通常为Y181C和Y188L)，降低NNRTIs结合所需要的芳香性作用，这种芳香作用在第一代NNRTI与RT的结合中占有重要地位，因此Y181C和Y188L变异株会使第一代中许多类型的NNRTIs产生耐药。其他变异如V106A、F227L和Y318F也会导致第二代NNRTIs疏水性作 用的缺失或改变，进而降低NNRTI与酶的亲和力。V106A变异通过改变周围氨基酸的位置及构象，从而间接影响NNRTIs的结合。NNIBP 中的 A98G、L1001、V1081、G190A/E、P225H、P236L 及 L234I 变异通过增加立体位阻直接或间接扰动周围的氨基酸来影响NNRTI与RT的结合。第三种耐药机制与K101E、K103N/T、E138K、V179D、E233V 及 K238T 变异有关。HAART的首要目标是最大限度地、持久地抑制病人体内病毒复制。但是，在实际临床治疗当中，部分病人达不到这样的效果，即使在初始治疗时能有效提升cd4+t细胞数量并显著降低血浆病毒载量的病人中，仍有相当一部分在持续治疗一段时间后血浆病毒载量出现反弹。这就意味着抗病毒治疗的失败。导致抗病毒治疗失败的原因是多方面的，其中HIV-1耐药性的产生是主要因素之一。目前，广泛应用于临床的几类抗病毒药物均有耐药株产生，HIV-1耐药株的传播已呈现上升的趋势，而且HIV病毒株常常会对同一类药当中的不同种药物产生交叉耐药性。耐药成为AIDS治疗面临的严峻挑战，同时耐药性检测逐渐成为帮助临床医生选择联合用药方案的重要工具。三、HIV-1病毒的耐药检测方法目前HIV-1病毒耐药性的检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的方法有直接测序法、异源双链轨迹试验(HTA)、PCR连续酶测定试验、线性探针试验、限制性内切酶酶切试验、引物特异的PCR测定、RNA酶(RNase)A错配剪切试验等，其中部分技术已有商用系统。在进行基因测序后，将测序结果与标准病毒株比较后可坦福大学耐药数据库(http://hivdb.Stanford, edu/)及Los Alamos HIV耐药数据库。通过输入所测得的序列，数据库可自动提供病毒基因变异及耐药结果。目前已有基于测序技术的商品本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是：包括以下8类特异性探针中的至少一类：检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:1~6中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:7~12中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:13~21中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:22~27中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:28~36中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因Y188L?、Y188H和Y188C突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:37~50中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:51~56中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针，为SEQ?ID?NO:57~65中的任意一种或任意一种的互补序列。...

【技术特征摘要】
1.检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是:包括以下8类特异性探针中的至少一类: 检测逆转录酶基因LlOOI突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 1 6中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 7 12中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 13 21中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针，为SEQ ID NO:22 27中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 28 36中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针，为SEQ ID NO:37 50中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 51 56中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 57 65中的任意一种或任意一种的互补序列。2.根据权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是: 所述检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针中，SEQ ID NO:1 3中的任意一种为针对第100位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID ΝΟ:Γ6中的任意一种为针对第100位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因Κ103Ν突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 7、中的任意一种为针对第103位氨基酸残基为K的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 1(Γ 2中的任意一种针对第103位氨基酸残基为N的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 13 15中的任意一种为针对第106位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 16 18中的任意一种为针对第106位氨基酸残基为A的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 19 21中为针对第106位氨基酸残基为M的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针中，SEQ ID NO:22 24中的任意一种为针对第108位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:25 27中的任意一种为针对第108位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因。所述检测逆转录酶基因Y181C和Υ181Ι突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 28 30中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID ΝΟ:3Γ33中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为C的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:34^36中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针中，SEQ IDNO:37 39中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO:40^42中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO:43^45中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为H的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO:46 50中的任意一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琼，李兰娟，项春生，吴南屏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：