本发明专利技术公开了一种检测人巨细胞病毒或含人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的荧光绝对定量PCR试剂盒。所述试剂盒包括以下组分：荧光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针和双蒸水。所述特异性引物对由SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ?ID?No.3所示。本发明专利技术设计了针对CMV启动子序列的特异性引物和探针，构建了实时荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强，灵敏度高，重复性好，检测线性范围广等特点，可以用于人巨细胞病毒感染的诊断，监测，也可以应用含CMV启动子的基因治疗产品的通用定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种检测人巨细胞病毒启动子或检测含人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的荧光定量PCR试剂盒，属于人巨细胞病毒或其启动子的检测领域。
技术介绍
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)的感染对人类健康造成严重威胁。HCMV几乎可以感染所有器官，它的感染一方面使细胞吞噬溶解功能、抗原呈递功能、分泌抗病毒细胞因子和调节因子的功能显著降低；另一方面通过抑制Th功能或下调感染细胞MHC-1类抗原表达，使被感染个体免疫功能下降。在感染发生过程中极早期启动子(major immediate early enhancer/promoter, MIEP)是病毒和宿主细胞发生相互作用的通信接口。人巨细胞病毒启动子能指导基因 在大多数的体外培养细胞中瞬时/稳定表达，是启动真核基因表达的强力启动子，该启动子参与构建的高效真核表达载体广泛应用于基因治疗产品和DNA疫苗的制备。人巨细胞病毒感染广泛存在、发病率高、危害大，尤其对于孕产妇、婴幼儿以及器官移植患者。对于HCMV感染患者就需要早诊断、早治疗，方法选择显得很重要。此外，也需要一种特异性强、灵敏度高的定量检测方法用于人巨细胞病毒(HCMV)基因疫苗的研制及其预防和治疗HCMV原发和再发感染效果的评价。病毒分离为最准确方法，是金标准。但耗时长，技术要求高，不适合临床推广。血清学检测虽然简便，但不适于早期检测及对HCMV感染状况的评价。以荧光标记探针为基础的实时荧光定量PCR技术，在目前国内的临床诊断中应用最为广泛。在探针法的实时荧光定量PCR反应体系中往往包括一对或多对特异性PCR引物及探针，通过研发过程中的条件摸索，探针及引物只与相对应的模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5 ^端标记有报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、ROX等，3'端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。迄今为止，用于检测人巨细胞病毒或含有人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的荧光定量PCR试剂盒均不同程度的存在特异性差、灵敏度低、检测线性范围较窄等缺陷，有待改进。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种能够准确的检测人巨细胞病毒或检测含有人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的荧光定量PCR试剂盒，该检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测线性范围广等优点。本专利技术的主要目的是通过以下技术方案来实现的:—种检测人巨细胞病毒或检测含有人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的荧光定量PCR试剂盒，包括以下各组分:荧光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针和双蒸水；所述的特异性引物对由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物组成；所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示。其中，在探针的5'端标记有荧光报告基团，所述的荧光报告基团是FAM、HEX或ROX荧光报告基团，优选为FAM荧光报告基团；在探针的3'端标记有荧光淬灭基团；所述的荧光淬灭基团可以是TAMRA、BHQ1或BHQ2等荧光淬灭基团，优选为TAMRA荧光淬灭基团。其中，所述的荧光聚合酶链式反应液包括:Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs ；为了得到绝对定量结果，所述的试剂盒中还包含有人巨细胞病毒启动子质粒标准品。所述人巨细胞病毒启动子质粒标准品可通过商业途径购买得到，也可参照以下方法构建得到:在PUC57质粒的Sam I酶切位点插入SEQ ID N0.4所示的基因片段，即得。本专利技术试剂盒中各组分的用量可根据待检测样品的数量以及每次荧光定量PCR反应所需的用量来确定或进行相应的调整，这些都是本领域所属技术人员视检测情况或实际需要很容易就能确定的参数。作为参考，采用本专利技术荧光定量PCR试剂盒检测人巨细胞病毒或含有人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的PCR反应条件和PCR反应体系如下:PCR反应体系:总体积25 μ 1，上/下游引物260nmol/L，探针IOOnmoI/L, 5XPCR缓冲液5 μ 1，dNTP200 μ mol/L, Mg2+3mmol/L, Ex Taq HS聚合酶1.5U，待检测的样品模板1.5 μ I,灭菌水 16 μ I。PCR 扩增条件:94°C 3min ；94°C 30s, 60°C lmin,40 个循环。本专利技术试剂盒可采用各种市售的荧光定量PCR仪进行分析和检测，所述的荧光定量 PCR 仪可以是 ABI 系列荧光定量 PCR 仪、B10RADiCycler、Roche4800、Qiagen Rotor Gene坐寸ο本专利技术试剂盒对检测样本的要求:检测样本来源:人外周血中DNA，动物血液和组织脏器中DNA或基因治疗产品中的DNA。样本制备:1、人血液中DNA的提取、动物组织脏器中DNA的提取以及基因治疗产品中的DNA的提取可以按照市售DNA提取试剂盒说明书操作，也可以按照以下提供的方法操作。2、称取约25mg左右的组织脏器，去除结缔组织，用剪刀剪成细小碎块。加10倍体积 DNA 提取缓冲液[50mM Tris Cl (ρΗ8.0)，0.IM EDTA (ρΗ8.0)，0.IM NaCl]，用超声匀浆仪进行匀浆。取200 μ I匀浆液于2ml的Eppendorf管中，缓慢加入20% SDS溶液，至终浓度I%，摇匀直至溶液变粘稠。再加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2-3h或过夜。并间歇搅动。或取200 μ I EDTA抗凝的全血或基因治疗产品，加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2_3h或过夜。 3、取出匀浆液，放置室温，加入50 μ 15Μ的NaCl至终浓度为1Μ。再加等体积饱和酌.抽提，以12, OOOrpm离心5min。4、取上清加1/2体积饱和酚，1/2体积氯仿/异戊醇抽提一次，以12，OOOrpm离心5min。5、取上清,加等体积氯仿/异戍醇抽提一次，12，OOOrpm离心5min。6、加1/10体积3M NaAcJ^ 2倍体积无水乙醇充分混匀，出现絮状沉淀，把液体连同沉淀一,决转移到吸附柱中，12，OOOrpm离心5min,弃废液。7、加 1111170% 乙醇漂洗，以 12，OOOrpm 离心 5min。8、室温放置干燥吸附柱后，加100 μ I TE溶解(60°C _70°C预热)，室温放置IOmin后 12，OOOrpm 离心 30sec。-20°C|C存备用。采用本专利技术试剂盒对检测样品进行定量分析的方法可参考以下步骤:1、质粒标准品浓度计算:当OD26tl= I时，相当于双链的DNA浓度为50ng/y 1，然后根据计算公式:DNA浓度(ng/ μ I) = 50 X OD260 X稀释倍数,计算质粒标准品浓度。2、待测样品定量:在每次测定中，用质粒标准品作标准曲线，待测样本中所得Ct值对应标准曲线中的拷贝数，即为所测拷贝数本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人巨细胞病毒或检测含人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：荧光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针和双蒸水。
【技术特征摘要】
1.一种检测人巨细胞病毒或检测含人巨细胞病毒启动子的基因治疗产品的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括以下各组分:荧光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针和双蒸水。2.按照权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述特异性引物对由SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示。3.按照权利要求2所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:在探针的5'端标记有荧光报告基团；在探针的3'端标记有荧光淬灭基团。4.按照权利要求3所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述的荧光报告基团包括FAM、HEX或ROX荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或BHQ2荧光淬灭基团。5.按照权利要求4所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述的荧光报告基团是FAM荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团是TAMRA荧光淬灭基团。6.按照权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗玉发，李波，沈连忠，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：
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