一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法技术

本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，其步骤：（1）在白色底透96孔细胞板中接种IBRS-2细胞，在37°C5%CO2温箱中培养；（2）弃去生长液，加入维持液，加入待筛选化合物，依次进行倍比稀释，混合均匀，在每个孔中加入猪伪狂犬病毒鄂A株，在同一块96孔板上，设置未加入病毒和化合物的对照、加入病毒未加化合物的对照，化合物溶解于二甲亚砜中；（3）在37°C5%CO2温箱中继续培养，加入Celltiterglo试剂，在高通量化学发光检测仪中检测，计算化合物的抑制率；（4）具有较高抑制率的化合物作为抗伪狂犬病毒的潜在药物。方法简便、快速、成本低、便于高通量操作，能够针对猪伪狂犬病毒在细胞中增殖的全部过程进行筛选，具有较高的成功率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物传染病防控和动物药物筛选
更具体涉及，在药物抑制猪伪狂犬病毒导致的细胞病变基础上，通过测定细胞活力，建立的针对猪伪狂犬病毒的体外药物筛选方法。
技术介绍
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)所引起的一种以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要症状的急性、接触性和高度致死性传染病。该病能引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎等，公猪表现睾丸炎、睾丸肿胀萎缩失去种用能力，仔猪表现高热、呼吸困难、流涎、呕吐、腹泻、食欲废绝以及抑郁震颤等症状，继而出现间歇性抽搐、昏迷以致衰竭死亡。伪狂犬病是引起我国猪繁殖疾病的主要原因，在养猪密集的地方可爆发流行。2周龄以内仔猪的发病率和死亡率几乎高达100%，断奶仔猪发病率为20% 40%，死亡率为10% 20%。成年猪感染后，常常继发细菌和病毒感染，加重病程和增加死亡率。猪伪狂犬病已给我国的养猪业造成了严重的经济损失，开发猪伪狂犬病的预防和治疗产品具有重要的经济价值。当前对于猪伪狂犬病的预防主要依赖于疫苗，且目前已成功开发并产业化了多种疫苗。用伪狂犬病毒强毒株经灭活、乳化后制备的灭活疫苗具有安全、免疫期长的优点，但免疫后对机体产生的刺激较大。经异源细胞传代致弱或基因工程改造致弱后，开发的伪狂犬病弱毒疫苗，具有免疫刺激小、免疫效果好的特点，但可能具有毒力返强的危险，近来有使用进口伪狂犬病弱毒疫苗后猪群发病的报道。疫苗都需要一定的免疫期才能产生较好的免疫保护效果，而药物使用后可迅速产生预防和治疗效果。对于猪伪狂犬病毒药物的研究在国内外仍未有报道，也没有可用的药物用于该病的预防和治疗。猪伪狂犬病毒 感染细胞后，可产生明显的细胞病变效应，病变细胞形态改变，活力降低，直至细胞死亡，与无病毒感染的细胞形成鲜明的对照，当化合物对病毒增殖具有抑制活性时，病毒导致的细胞病变效应下降，因此对病毒感染的细胞进行活力测定，可评估伪狂犬病毒在细胞中的增殖状况，进而建立针对猪伪狂犬病毒的药物高通量筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了，该方法简便、快速、成本低、便于高通量操作，能够针对猪伪狂犬病毒在细胞中增殖的全部过程进行筛选，具有较高的成功率。同时应用该方法筛选到一种抗猪伪狂犬病毒的化合物BVDUji猪伪狂犬病毒强度株具有很好的抑制效果，且对猪伪狂犬病毒活疫苗毒株无抑制效果，是一种理想的抗伪狂犬病毒潜在药物。本专利技术通过以下技术方案实现:，其步骤是:(I)在白色底透96孔细胞板中接种IBRS-2细胞(猪肾细胞系，该细胞系在相关领域长期普遍)，细胞的接种密度为5000个/孔，在37° C 5%C02温箱中培养10-14小时。(2)弃去生长液，在第一孔加入98yL维持液(DMEM中含有1%(ν/ν)牛血清和1%(ν/ν)双抗)，其它孔加入50μ L维持液，再在第一孔加入2μ L待筛选化合物，依次进行倍比稀释，混合均匀后，在每个孔中均加入50 μ L 0.02Μ0Ι的猪伪狂犬病毒鄂A株。在同一块96孔板上，设置未加入病毒和化合物的对照、加入病毒未加化合物的对照。由于化合物均是溶解于二甲亚砜(DMSO)中，因此在所有对照组中加入l%(v/v)DMS0。(3)在 37° C 5%C02 温箱中继续培养 46-50 小时后，加入 IOOyL Celltiter glo试剂(PiOme ga公司)，反应9-11分钟后，在高通量化学发光检测仪中检测，计算化合物的抑制率。(4)化合物抑制率％=(待筛化合物孔的化学发光值-病毒对照组化学发光值的平均值)/ (细胞对照组化学发光值的平均值-病毒对照组化学发光值的平均值)。对不同化合物的抑制率进行计算，得到抑制率较高的化合物作为抗伪狂犬病毒的潜在药物。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果:A.本专利技术中建立的猪伪狂犬病毒药物高通量筛选技术具有准确、直接、易于实现自动化的优点，较传统的MTT法更加准确。同时本专利技术中的方法还可同时对化合物进行倍比稀释后，测定同一化合物不同浓度下的抗病毒活性，有效提高了命中率。B.本专利技术中筛选得到的化合物(E)_5_(2-Bromovinyl)_2’ -deoxyuridine (以下简称BVDU)对猪伪狂犬病毒药物的抗病毒效果:通过抗病毒试验测定BVDU对猪伪狂犬病毒抑制的半数有效浓度(EC50)低于1.56μΜ，半数细胞抑制浓度(CC50)为105.1 μ M，BVDU对猪伪狂犬病毒的选择性指数(SI)大于100，可作为理想的抗猪伪狂犬病毒候选药物。同时还发现BVDU对TK基因缺失的弱毒疫苗株的抑制率低于25%，因此BVDU使用后不会影响疫苗的免疫效果。 C.本专利技术中筛选得到的BVDU对伪狂犬病毒的抑制效果是广谱抗病毒药物利巴韦林的30倍，是疱疹病毒特效药阿昔洛韦的62倍。附图说明图1为不同接种密度下细胞的生长曲线示意图。图中说明细胞在5000个/孔时，其生长与时间成正比。图2为不同细胞接种密度下病毒感染后的细胞生长曲线示意图。图中说明细胞密度为5000个/孔时，接种病毒后，细胞活力与时间成反比。图3为不同剂量的病毒感染后S/B值变化示意图。S/B值为正常细胞中测定的化学发光值+接种病毒细胞中测定的化学发光值。图中说明细胞密度在5000个/孔时，以0.01Μ0Ι接种病毒，S/B值大于10。图4为DMSO对细胞活力的影响示意图。DMSO浓度小于2%时，不影响细胞生长。图5为用高通量筛选技术对48种化合物进行筛选的示意图。对48种化合物进行复筛，其中6种的抑制率大于20%。图6为BVDU对猪伪狂犬病毒野毒株和疫苗毒株的抑制效果示意图。BVDU对猪伪狂犬病毒野毒的抑制率均>65%，而对TK基因缺失的疫苗株抑制率均〈20%。图7为空斑减少试验检测BVDU对猪伪狂犬病毒的抑制效果示意图。图中Mock组为不加入任何化合物的对照组。BVDU浓度在1.56uM及以上时，可完全抑制伪狂犬病毒的生长。图8为BVDU对细胞的抑制活性检测示意图。图中说明BVDU浓度在IOOuM及以下时，不影响细胞的生长。图9为BVDU结构式示意图。具体实施例方式实施例1:，其步骤是:(I)高通量筛选中最佳细胞接种密度和检测终点的确定:为寻找到最佳的细胞接种密度，在96孔细胞培养板上接种IOOyL 5000cells/孔、7500cells/ 孔、lOOOOcells/ 孔、15000cells/ 孔和 20000cells/ 孔，并连续培养至 96h。培养期间每隔24h使用CellTiter glo检测细胞活力。结果显示细胞对照组统计结果显示在72h内细胞活力呈持续增长趋势；72h到96h细胞活力开始下降，表明细胞在培养至96h后已过度生长出现死亡(附图1)。病毒对照组相同条件下培养至96h，每隔24h相同方法检测一次。检测结果显示24h到48h内细胞活力呈持续上升趋势；48h后随着培养时间延长细胞病变逐渐明显，细胞活力 下降(附图2)。其中每孔接种5000cells培养至72h时S/B值为24.U因子为0.68、细胞CV值和病毒CV值分别为9.94%和10%，满足高通量筛选要求。因此选择每孔接种100 μ L 5000cells培养至72h作为检测终点完成后续试验。(2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪伪狂犬病毒的高通量药物筛选的方法，其步骤是：???（1）在白色底透96孔细胞板中接种IBRS?2细胞，细胞的接种密度为5000个/孔，在37°C?5%?CO2温箱中培养10?14小时；???（2）弃去生长液，在第一孔加入98μL维持液：DMEM中含有1%v/v牛血清和1%v/v双抗，其它孔加入50μL维持液，再在第一孔加入2μL待筛选化合物，依次进行倍比稀释，混合均匀后，在每个孔中均加入50μL?0.02MOI的猪伪狂犬病毒鄂A株，在同一块96孔板上，设置未加入病毒和化合物的对照、加入病毒未加化合物的对照，化合物均是溶解于二甲亚砜中，在所有对照组中加入1%v/vDMSO；???（3）在37°C?5%?CO2温箱中继续培养46?50小时后，加入100μL?Celltiter?glo试剂，反应9?11分钟后，在高通量化学发光检测仪中检测，计算化合物的抑制率；???（4）化合物抑制率%=待筛化合物孔的化学发光值?病毒对照组化学发光值的平均/细胞对照组化学发光值的平均值?病毒对照组化学发光值的平均值，对不同化合物的抑制率进行计算，得到抑制率的化合物作为抗伪狂犬病毒的潜在药物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋云峰，周锐，王翠，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：