用于转基因植物的高通量筛选方法技术

本发明专利技术涉及使用定量或实时聚合酶链反应(QPCR或实时PCR)用于定量转基因植物中异源多核苷酸的表达水平或拷贝数，其中所述实时PCR是使用可操作地连接至所述异源多核苷酸的异源终止子序列特异性的引物组进行的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及使用定量或实时聚合酶链反应(QPCR或实时PCR)用于定量转基因植物中异源多核苷酸的表达水平或拷贝数，其中所述实时PCR是使用可操作地连接至所述异源多核苷酸的异源终止子序列特异性的引物组进行的。【专利说明】 相关申请的夺叉引用 本专利申请要求提交于2011年8月2日的美国临时申请61 / 514052的权益，其 全部内容以引用方式并入本文。
本专利技术涉及植物基因工程。其涉及用于筛选转基因植物对于转基因的存在和表达 的方法和组合物。
技术介绍
植物基因工程近来的进步已打开了工程化植物以具有改善的特性或性状的新的 大门。这些转基因植物在其基因组中典型地具有重组DNA体，其具有可操作地连接至多个 调控区的转基因，所述调控区使所述转基因准确的表达。转基因植物中几个帮助调控基因 表达的调控元件的例子为启动子、内含子、终止子、增强子和沉默子。 植物基因工程已发展至将多种性状引入商业上重要的植物中，也称为基因堆积。 这是通过多基因转化实现的，多种基因在其中被转化，以产生可能表达复合表型或多种表 型的转基因植物。 调控序列位于包含转录终止和3' mRNA加工所需信号的编码区的下游，被称为终 止子序列。所述终止子序列在mRNA加工、定位、稳定性和翻译中起关键作用（Proudfoot， N, (2004)Curr Opin Cell Bioll6 :272-278 ；Gilmartin, G. M. (2005)Genes Dev. 19 ： 2517-2521。包含在终止子序列中的3'调控序列能够影响基因的表达水平（Ingelbrecht 等人（1989)Plant Celll :671-680)。 基因工程的挑战之一是转基因植物的分子鉴定，以检测和测量转基因植物中转基 因的拷贝数和表达。所述转基因 DNA是被随机插入植物基因组中，能导致在一个或多个染 色体位点整合进多个转基因拷贝的转基因植物中基因沉默。因此转基因拷贝数的估算是 转基因植物的分子鉴定的重要步骤。已经采用技术诸如southern印记、比较基因组杂交、 荧光原位杂交和使用基因特异性引物的聚合酶链反应（PCR)以测量所述转基因的拷贝数 (Yang 等人 Plant Cell Rep(2005)23 :759-763)。采用技术诸如 Northern 印记和使用基 因特异性引物的逆转录酶PCR以对转基因的表达定量。这些技术可以是乏味的并容易出错 (Toplak 等人 2004 ;Plant Molecular Biology Reporter22 :237-250)。 使用定量或实时PCR用于测定转基因植物中转基因表达或拷贝数是有缺点的，因 为当对于每个不同的转基因用基因特异性引物和探针时它可能是昂贵的。此外，每个引物 组的效率可能不同，这会妨碍以高通量方式对转基因拷贝数和表达分析的测定。如果所述 转基因植物除了被引入的拷贝外有所述基因的内源性拷贝，测量特异性来自所述转基因的 表达可以为困难的。
技术实现思路
本专利技术涉使用定量或实时聚合酶链反应（QPCR或实时PCR)用于量化转基因植物 中异源多核苷酸的表达水平或量化其拷贝数的方法，其中使用了对可操作地连接至异源多 核苷酸的异源终止子序列特异性的引物组进行实时PCR。本专利技术所述方法能用于以高通量 方式测定转基因植物中异源多核苷酸的表达水平或拷贝数。 本专利技术的一个实施例是量化转基因植物或植物细胞中异源多核苷酸表达水平的 方法，所述方法包括以下步骤：(a)从转基因植物或植物细胞分离核酸，其中所述转基因植 物或植物细胞包含可操作地连接至异源终止子序列的异源多核苷酸；以及（b)使用正向引 物和反向引物通过实时逆转录酶聚合酶链反应来量化所述异源多核苷酸的表达水平，其中 所述正向引物和所述反向引物与所述异源终止子序列或其互补序列杂交。在另一个实施例 中，使用与所述异源终止子序列或其互补序列杂交的探针通过定量或实时逆转录酶PCR来 进行所述异源多核苷酸的表达水平的量化。 本专利技术的另一个实施例是测量转基因植物或植物细胞中异源多核苷酸的拷贝数 的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从转基因植物或植物细胞分离核酸，其中所述转基因 植物或植物细胞包含可操作地连接至异源终止子序列的异源多核苷酸；以及（b)使用正向 引物和反向引物通过实时聚合酶链反应来量化所述异源多核苷酸的拷贝数，其中所述正向 引物和所述反向引物与所述异源终止子序列或其互补序列杂交。在另一个实施例中，使用 与所述异源终止子序列或其互补序列杂交的探针通过定量实时PCR来进行所述异源多核 苷酸的拷贝数的量化。 本专利技术的另一个实施例是量化在至少两个转基因植物或植物细胞中存在的至少 两个异源多核苷酸的表达水平的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从至少两个转基因植 物或植物细胞分离核酸，其中第一转基因植物或植物细胞包含可操作地连接至异源终止子 序列的第一异源多核苷酸，并且其中第二转基因植物或植物细胞包含可操作地连接至所述 异源终止子序列的第二异源多核苷酸；(b)任选地，从附加的转基因植物或植物细胞分离 核酸，其中所述附加的转基因植物或植物细胞中的每一个包含可操作地连接至所述异源终 止子序列的附加的异源多核苷酸；以及（c)使用正向引物和反向引物通过实时逆转录酶聚 合酶链反应来量化所述第一异源多核苷酸、第二多核苷酸和任选的附加异源多核苷酸的表 达水平，其中所述正向引物和所述反向引物与所述异源终止子序列或其互补序列杂交。在 一个实施例中，对于至少一百附加的转基因植物或植物细胞进行来自步骤（b)的附加转基 因植物或植物细胞的核酸的分离和步骤（c)的任选的附加异源多核苷酸的表达水平的量 化。在一个实施例中使用这个方法来量化在至少两个转基因植物或植物细胞中存在的至少 两个异源多核苷酸的拷贝数，其中每个异源多核苷酸可操作地连接至所述异源终止子。 在任何所述方法的另一个实施例中，所述异源终止子序列包含SB-GKAF终止子序 列。在另一个实施例中，所述异源终止子序列的序列包含SEQ ID N0 :1。在另一个实施例 中，所述正向引物、反向引物和探针与SEQ ID N0 :1或其互补序列杂交。在另一个实施例中， 所述异源终止子序列包含所述SB-GKAF终止子序列，所述探针杂交至由所述正向引物和所 述反向引物界定的SB-GKAF终止子序列的区域。在另一个实施例中，所述异源终止子序列 包含SEQ ID N0:1，所述正向引物包含SEQ ID N0:2,所述反向引物包含SEQ ID N0:3,并且 所述引物包含SEQ ID NO :4。在另一个实施例中，所述异源终止子序列包含SEQ ID NO :1， 所述正向引物包含SEQ ID NO :5,所述反向引物包含SEQ ID NO :6,并且所述引物包含SEQ ID NO :7。 在任何所述方法的另一个实施例中，所述转基因植物或植物细胞是玉米植物或植 物细胞。 附图和序列表简沭 根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本专利技术，以下的详 细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以 三个字母表不氛基酸，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
量化转基因植物或植物细胞中异源多核苷酸的表达水平的方法，所述方法包括以下步骤：a.从转基因植物或植物细胞分离核酸，其中所述转基因植物或植物细胞包含可操作地连接至异源终止子序列的异源多核苷酸；以及b.使用正向引物和反向引物通过实时逆转录酶聚合酶链反应来量化所述异源多核苷酸的表达水平，其中所述正向引物和所述反向引物与所述异源终止子序列或其互补序列杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A斯拉特里，IC奥里维拉，D奥内尔，J邹，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US