【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗肿瘤生物制品领域，特别涉及一种新型单域抗体双特异性t细胞激动剂cd3-cd105/nb-bite及其制备方法与应用。
技术介绍
1、目前，以靶向肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)的免疫治疗策略因其独特的优势受到愈来愈多的关注。但是，tme是一个高度复杂的机体内环境体系，除了主体的肿瘤细胞以外，肿瘤基质中存在大量与肿瘤细胞本身密切的成纤维细胞、免疫细胞、胶质细胞、微血管内皮细胞以及浸润的生物分子等。这些复杂的成分都是肿瘤生长发育以及免疫逃逸的“重要帮凶”，从而对肿瘤的治疗带来困难以及挑战。
2、传统的t细胞识别肿瘤细胞需要肿瘤细胞表面的特异性肿瘤相关抗原(target-associated antigen,taa)借助主要组织相容性复合物(major histocompatibilitycomplex,mhc)分子将信号转导至t细胞表面的受体(t-cell receptor，tcr)以诱导t细胞活化，具有mhc限制性，而且完整的t细胞活化及免疫反应过程仍需要共刺激信号(主要是cd28)，这无疑是增加了抗原识别的难度，降低了t细胞的活化效率。
3、传统的bite(bispecific t-cell engager，双特异性激动剂，有时称为双特异性衔接体)是将抗cd3单链抗体(single chain variable fragment,scfv，也称为单链可变区片段)与抗不同肿瘤细胞抗原的scfv通过肽段进行连接而获得，可同时结合cd3+的t细胞及肿瘤细胞且诱导
4、但是，这种基于scfv的bite鉴于其结构因素仍然存在一定的不足：例如引起中性粒细胞减少、转氨酶升高、神经毒性以及细胞因子风暴等治疗相关不良事件。此外，基于scfv的bite还会受限于其分子量而无法穿透血脑屏障进入病灶区或者实体瘤内部，从而使其治疗效果大打折扣。
5、1993年hamers-casterman及其团队首次报道称在骆驼体内存在天然缺失轻链的重链抗体，通过基因工程技术克隆其重链可变区而得到的纳米抗体(nanobody,nb)，又称单域抗体(single-domain antibody,sdabs)。nbs的生产可以使用多种不同的表达模型，包括细菌、酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞甚至植物宿主等生物。目前最广泛使用的表达系统是大肠杆菌，它能够在不同的细胞区室中表达蛋白质，最主要优点是它能够产生可溶性功能性nbs且成本低廉，然而与酵母或真菌等表达系统相比，产量相对较低。当nbs作为药物用于治疗时，通常选择哺乳动物细胞作为表达系统，但是由于表达时间长，过程复杂以及成本高，因此常常不能成为首选。
6、因此，目前继续一种能够克服上述现有技术中的问题的基于t细胞的抗肿瘤免疫治疗提供一种新的策略和技术手段。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种新型单域抗体双特异性t细胞激动剂cd3-cd105/nb-bite及其制备方法与应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术在第一方面提供了一种t细胞激动剂，其特征在于，所述t细胞激动剂包含：(1)能够特异性结合cd105+肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞表面cd105分子的第一功能域；和(2)能够特异性结合并有效激活t细胞表面cd3分子的第二功能域。
4、本专利技术在第二方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的t细胞激动剂。
5、本专利技术在第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有根据本专利技术第二方面所述的多核苷酸。
6、本专利技术在第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转化有本专利技术第三方面所述的表达载体。
7、本专利技术在第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合包含本专利技术第一方面所述的t细胞激动剂和可药用载体。
8、本专利技术在第六方面提供了一种根据本专利技术第一方面所述的t细胞激动剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
9、(1)构建含有所述t细胞激动剂的基因序列的原核表达载体；和
10、(2)将所述原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达并纯化，从而获得所述t细胞激动剂。
11、本专利技术在第七方面提供了一种根据根据本专利技术第一方面所述的t细胞激动剂在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
12、本专利技术的新型t细胞激动剂(cd3-cd105/nb-bite)相对于现有技术具有如下技术优势：
13、(1)对肿瘤细胞尤其是cd105+肿瘤细胞具有优异的靶向特异性、增殖抑制特异性和杀伤特异性(图实施例5和6的试验结果等所示)。
14、(2)对正常的组织细胞没有毒性(如实施例4的试验结果等所示)；
15、(3)本专利技术的新型t细胞激动剂(cd3-cd105/nb-bite)以单域抗体作为结构基础的双特异性t细胞激动剂，赋予t细胞激动剂以单域抗体的诸多优势，如体积小，抗原结合性能好，容易基因工程改造和实现大量生产，免疫原性弱以及不同特性单域抗体可以相互连接而不会产生错误配对的问题等。
16、(4)本专利技术的新型t细胞激动剂(cd3-cd105/nb-bite)的一些优选的制备方法采用原核细胞表达系统生产，其成本低廉，蛋白产量高，使用方便，可工业化生产，具有良好的发展前景且适于推广使用。
17、(5)本专利技术的新型t细胞激动剂(cd3-cd105/nb-bite)可同时与t细胞表面cd3分子，cd105+肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞表面cd105分子特异性结合，在t细胞和肿瘤新生血管内皮细胞之间形成有效激活t细胞的免疫突触和信号连接，介导肿瘤新生血管内皮细胞的裂解而产生抗肿瘤效应，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的临床应用前景。
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1.一种T细胞激动剂，其特征在于，所述T细胞激动剂包含：(1)能够特异性结合CD105+肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞表面CD105分子的第一功能域；和(2)能够特异性结合并有效激活T细胞表面CD3分子的第二功能域。
2.根据权利要求1所述的新型T细胞激动剂，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的T细胞激动剂，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的T细胞激动剂，其特征在于：
5.一种多核苷酸，其特征在于：
6.一种表达载体，其特征在于：
7.一种宿主细胞，其特征在于：
8.一种药物组合物，其特征在于：
9.一种根据权利要求1至4中任一项所述的T细胞激动剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
10.一种根据权利要求1至4中任一项所述的T细胞激动剂在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种t细胞激动剂，其特征在于，所述t细胞激动剂包含：(1)能够特异性结合cd105+肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞表面cd105分子的第一功能域；和(2)能够特异性结合并有效激活t细胞表面cd3分子的第二功能域。
2.根据权利要求1所述的新型t细胞激动剂，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的t细胞激动剂，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的t细胞激动...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，杨晓梅，林轩东，汤卓然，段斯亮，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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