具有增强的复制特性的溶瘤腺病毒组合物制造技术

描述了在E3区域具有缺失或修饰的肿瘤选择性重组腺病毒。表达腺病毒死亡蛋白(ADP)但其余六个E3基因中至少三个缺失的重组腺病毒表现出增强的病毒复制能力。重组腺病毒还包括其它修饰，以允许在肿瘤细胞中选择性复制并使病毒脱靶于肝脏。描述了重组腺病毒在癌症治疗中的用途。中的用途。中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增强的复制特性的溶瘤腺病毒组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年4月9日提交的美国临时申请号62/655,009的权益，通过引用将其整体并入本文。


[0003]本公开涉及在E3区域中具有缺失或其它修饰的肿瘤选择性重组腺病毒，其增强了病毒复制。本公开进一步涉及重组腺病毒在癌症治疗中的用途。

技术介绍

[0004]癌症是一种复杂的、使人衰弱的疾病，每年导致超过五十万人死亡。迫切需要更有效、更具选择性和更安全的癌症治疗方法。现有的疗法(例如化学疗法和外科手术)很少能消除所有恶性细胞，并且经常表现出有害的副作用，其可能超过治疗益处。
[0005]一种有潜力解决当前癌症治疗方法许多缺点的方法是溶瘤腺病毒治疗(Pesonen等，Molecular Pharmaceutics 8(1)：12-28，2010)。腺病毒(Ad)是一种自我复制的生物机器。它由包裹在蛋白质外壳中的线性双链36kb DNA基因组组成。腺病毒侵入并劫持细胞复制机制以繁殖，并在组装后诱导裂解细胞死亡以扩散至周围细胞。这些非常相同的细胞控制是癌症突变的目标。可以利用这些知识来制造合成病毒，其作用类似于导弹，特别是在肿瘤细胞中感染和复制，并裂解细胞以释放成千上万的病毒后代，这些后代可以寻找并破坏远处的转移，同时克服可能的耐药性。因此，溶瘤病毒设计的目的是产生一种在癌细胞中特异性复制但不会损害正常细胞的病毒。然而，在设计可以选择性地在癌细胞中复制的病毒方面存在重大挑战。因此，仍然需要在癌细胞中高效选择性复制的病毒。此外，许多溶瘤病毒已在临床试验中证明对人类癌症患者是安全的，但大多数在治疗晚期癌症方面均达不到效果。因此，与当前的现有技术相比，仍然需要开发具有增强的效力的病毒。

技术实现思路

[0006]公开了在肿瘤细胞中表现出增强的复制动力学的重组腺病毒。还描述了编码在肿瘤细胞中复制增强的重组腺病毒的重组腺病毒基因组。
[0007]本文提供了重组腺病毒基因组，其包括编码修饰的E1A蛋白的E1A区域；编码腺病毒死亡蛋白(ADP)的E3区域，并在选自于12.5k、6.7k、19k、RIDα、RIDβ和14.7k的至少三个E3基因的编码序列中有修饰，其中，所述修饰阻止了所编码的蛋白质的表达；以及E4区域，其包含E4orf6/7编码序列的修饰(例如缺失)。
[0008]在一些实施方案中，重组腺病毒基因组进一步编码靶向配体，进一步编码嵌合纤维蛋白，进一步包括至少一种修饰以使腺病毒脱靶于肝脏，进一步包括异源开放阅读框(ORF)，进一步包括缺失E4orf3，或其任意组合。
[0009]还提供了包含本文公开的重组腺病毒基因组的分离的细胞。还提供了包含重组腺病毒基因组的组合物。
CO1042(2
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108PFU)，总体积为50μl。由于肿瘤负担，必须在第30天之前处死生理盐水治疗组中的所有动物。
[0021]图7A-7B是示出在C57BL/6小鼠中重组腺病毒的安全性和毒性研究结果的图。以指定剂量在第0天以200μl的体积将四种不同病毒静脉内施用于不同组的小鼠(每组n＝5只小鼠)，并在第7天重复一次。然后分析小鼠的存活率(图7A)和肝酶升高(图7B)以对肝毒性进行评估。(图7A)监测小鼠的存活和毒性的总体征，直到第14天。尽管WT Ad5以4
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109PFU的剂量引起致命毒性，但在该剂量下AdSyn-CO181和AdSyn-CO331均被耐受。AdSyn-CO1042的耐受剂量甚至更高，为2
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10
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PFU。(图7B)在第-2天(给药前)、第2天(给药1后48小时)和第9天(给药2后48小时)从所有小鼠中采集血样，并冷冻以用于随后的分析。评估血液样本中各种肝酶的存在，例如丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。显示的结果是各个治疗组第2天血液的平均AST和ALT水平。还示出了所有小鼠的AST和ALT的平均给药前水平。
[0022]图8是示出了AdSyn-CO1000对BALB/c小鼠的毒性的表。在第0天、第6天和第12天以指定剂量将200μl体积的两种不同病毒静脉内施用于不同组的小鼠(每组n＝5只小鼠)。然后分析小鼠的存活以对毒性进行评估。然而，WT Ad5在0.8
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109PFU的剂量下，在5只小鼠中有2只引发致死毒性，并在3.2
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109PFU的较高剂量下杀死所有小鼠，AdSyn-CO1000在1
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109PFU和4
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109PFU更高的剂量下更安全。
[0023]图9是示出了在A549肺肿瘤异种移植模型中静脉内递送的AdSyn-CO1042的体内功效的图。通过将5
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106个细胞注射到乳腺脂肪垫中，将人A549肿瘤细胞接种到NSG小鼠中。当肿瘤的平均体积达到～184mm3(第0天)时，将小鼠随机分为不同的治疗组(每组n＝8只小鼠)。给小鼠单次注射PBS(盐水)或单次IV注射2
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109PFU的AdSyn-CO1042。由于肿瘤负担，必须在第33天之前处死盐水治疗组中的所有动物。野生型Ad5无法以2
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109PFU的剂量递送，因为该剂量会导致死亡。
[0024]图10是示出了AdSyn-CO1000和AdSyn-CO1042的肿瘤选择性复制的一组图。人A549细胞(肺癌)或人原发性小气道上皮细胞(SAEC-正常肺)以每细胞0.12病毒颗粒的MOI感染了四种溶瘤病毒。所有病毒都将YPet荧光团编码为报告基因，以量化病毒随时间的复制/扩张。病毒感染后，立即在IncuCyte ZOOM成像系统中每小时对病毒感染的细胞进行一次成像，以量化在6-7天内YPet+病毒感染的细胞的数量。数据表示为一段时间内YPet+细胞的数量。AdSyn-CO874和AdSyn-CO1000是相同的病毒，除了AdSyn-CO1000具有赋予肿瘤选择性复制的ΔLXCXE和ΔE4orf6/7突变，以及肝脏脱靶六邻体突变之外。同样，AdSyn-CO1041和AdSyn-CO1042是相同的病毒，除了AdSyn-CO1042具有ΔLXCXE和ΔE4orf6/7突变，以及肝脏脱靶六邻体突变。在肿瘤细胞中，与AdSyn-CO874和AdSyn-CO1041相比，AdSyn-CO1000和AdSyn-CO1042分别显示出相似的病毒扩展/复制水平。然而，在正常肺细胞中，与AdSyn-CO874和AdSyn-CO1041相比，AdSyn-CO1000和AdSyn-CO1042的扩张/复制能力明显降低。
[0025]图11是证明了E3B区域的缺失或消除对腺病毒复制的影响的柱状图。使用基于荧光的病毒动力学(FBVK)分析评估了四种不同的重组病毒，以确定在人A549肺肿瘤细胞中的复制速率。该图示出了编码Ypet荧光蛋白的每种重组腺病毒的自然对数斜率(ln-slope)值。在AdSyn-CO869中，RIDα、R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组腺病毒基因组，包括：E1A区域，其编码修饰的E1a蛋白；E3区域，其编码腺病毒死亡蛋白(ADP)并在选自于12.5k、6.7k、19k、RIDα、RIDβ和14.7k的至少三个E3基因的编码序列中包含修饰，其中，所述修饰阻止了所述编码的蛋白质的表达；以及E4区域，其包含E4orf6/7编码序列的缺失。2.根据权利要求1所述的重组腺病毒基因组，其中，所述修饰的E1a蛋白包括：LXCXE基序的缺失；残基2-11的缺失；C124G替换；Y47H替换；Y47H替换和C124G替换；或Y47H替换、C124G替换和残基2-11的缺失。3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组腺病毒基因组，其中，所述至少三个E3基因包括12.5k、6.7k和19k。4.根据权利要求3所述的重组腺病毒基因组，其中，所述12.5k、6.7k和19k基因缺失。5.根据权利要求3所述的重组腺病毒基因组，其中，所述12.5k、6.7k和19k基因包含起始密码子的突变，引入提前终止密码子的突变，或两者。6.根据权利要求1或权利要求2所述的重组腺病毒基因组，其中，所述至少三个E3基因包括RIDα、RIDβ和14.7k。7.根据权利要求6所述的重组腺病毒基因组，其中，所述RIDα、RIDβ和14.7k基因缺失。8.根据权利要求6所述的重组腺病毒基因组，其中，所述RIDα、RIDβ和14.7k基因包含起始密码子的突变，引入提前终止密码子的突变，或两者。9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组腺病毒基因组，其中，所述至少三个E3基因包括12.5k、6.7k、19k、RIDα、RIDβ和14.7k。10.根据权利要求9所述的重组腺病毒基因组，其中，所述12.5k、6.7k、19k、RIDα、RIDβ和14.7k基因缺失。11.根据权利要求9所述的重组腺病毒基因组，其中，所述12.5k、6.7k、19k、RIDα、RIDβ和14.7k基因包含起始密码子的突变，引入提前终止密码子的突变，或两者。12.根据权利要求1-11中任一项所述的重组腺病毒基因组，其进一步包含E4orf3的缺失。13.根据权利要求1-12中任一项所述的重组腺病毒基因组，其中，所述基因组进一步编码与FK506结合蛋白(FKBP)融合的靶向配体，和与野生型FKBP-雷帕霉素结合(FRB)蛋白融合的腺病毒纤维蛋白或能够结合rapalog的突变FRB蛋白。14.根据权利要求13所述的重组腺病毒基因组，其中，所述靶向配体是单结构域抗体。15.根据权利要求14所述的重组腺病毒基因组，其中，所述单结构域抗体对EGFR具有特异性。16.根据权利要求1-15中任一项所述的重组腺病毒基因组，其包含至少一种修饰以使腺病毒脱靶于肝脏。
NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59具有至少99％同一性。36.根据权利要求1所述的重组腺病毒基因组，其中，所述基因组的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：发明
国别省市：