肿瘤靶向合成腺病毒及其用途制造技术

本发明专利技术描述了合成腺病毒，其具有肝脏去靶向突变并表达腺病毒34型(Ad34)纤维蛋白或者具有Ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。所述合成腺病毒运送至肿瘤部位。还描述了所述合成腺病毒用于将诊断性或治疗性转基因递送至肿瘤的用途。

Tumor-targeted synthesis of adenovirus and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肿瘤靶向合成腺病毒及其用途相关申请的交叉引用本申请要求2016年12月12日提交的美国临时申请号62/433,140的优先权，该申请通过引用全文结合入本文。
本公开涉及运送至肿瘤部位的具有嵌合纤维蛋白和肝脏去靶向突变的合成腺病毒。本公开还涉及合成腺病毒在肿瘤中表达诊断性或治疗性转基因的用途。
技术介绍
腺病毒(Ad)是天然的多基因表达载体。该病毒的某些编码区例如E1、E3和E4区对于培养中的复制而言并非是必要的，或者可以通过可用的细胞系补充。因此，这些区的每一个可以被非病毒基因替代，以驱动多个转基因自单一病毒的表达。有68种不同的人腺病毒血清型，其每一种均具有不同的特性。Ad5是基础研究、基因疗法和溶瘤病毒疗法中使用的主要Ad载体。但是，Ad5的趋向性(tropism)有限，仅感染具有用于病毒摄入的柯萨奇腺病毒受体(CAR)的上皮细胞。而且，当静脉注射时，Ad5与血液因子结合，导致其在肝脏中被隔离，在肝脏中它可能潜在地触发限制性炎症和毒性。因此，仍需要有在静脉施用之后能够感染特定细胞类型的修饰的腺病毒载体。
技术实现思路
本文说明如下发现：表达具有腺病毒34型(Ad34)隆突结构域(knobdomain)的纤维蛋白的肝脏去靶向合成腺病毒能够归巢至肿瘤部位。所述合成腺病毒可用于在肿瘤细胞(包括肿瘤基质细胞)中递送和表达诊断性或治疗性转基因。本文提供在受试者肿瘤细胞中表达转基因的方法。在一些实施方式中，该方法包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：转基因、使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳和Ad34纤维蛋白或包括腺病毒5型(Ad5)轴结构域(shaftdomain)和Ad34纽结构域的嵌合纤维蛋白。例如，所述转基因可以是诊断性转基因或治疗性转基因。本文还提供诊断受试者患有肿瘤的方法。在一些实施方式中，该方法包括给受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：诊断性转基因，使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳，和Ad34纤维蛋白或包括Ad5轴结构域和Ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。在一些例子中，所述诊断性转基因是正电子发射断层成像术(PET)报道基因。在其它例子中，所述诊断性转基因编码荧光蛋白或酶。本文还提供治疗受试者中肿瘤的方法。在一些实施方式中，该方法包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：治疗性转基因、使合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳和Ad34纤维蛋白或包括Ad5轴结构域和Ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。在一些例子中，所述治疗性转基因编码抗癌药剂或者破坏或杀死肿瘤基质细胞的药剂。本公开还提供与SEQIDNO:2或SEQIDNO:5具有至少95％序列同一性的合成腺病毒基因组。以下详述参考附图进行，本公开内容的前述和其他目的和特征从以下详述将会更加地显而易见。附图说明图1A-1B.AdSyn-CO176归巢至胰腺肿瘤。(图1A)Cre-LoxPKrasG12D/p53胰腺肿瘤模型概述。命名为“Kras；p53/p53”的小鼠编码KrasG12D致癌基因，该致癌基因位于编码LoxP-终止密码子-LoxP的序列的下游。该终止密码子在不存在Cre重组酶的情况下阻断KrasG12D的表达。但是，在Cre重组酶的存在下，终止密码子被移除并允许KrasG12D致癌基因的表达。在这些相同的小鼠中，p53基因的两个等位基因的侧翼为LoxP位点(LoxP-p53-LoxP)。命名为“p53/p53；Cre”的小鼠具有侧翼为LoxP位点的p53基因的两个等位基因(LoxP-p53-LoxP)，并且还在胰十二指肠同源盒1(Pdx1)启动子的驱动下表达Cre重组酶转基因。Pdx1是在胰腺细胞中被特异性表达的基因，因此胰腺细胞中缺失两个拷贝的p53。株系之间的繁殖产生这样的后代，其中Pdx1启动子驱动的Cre在胰腺细胞中介导肿瘤抑制基因p53的两个等位基因的缺失和突变体KrasG12D的激活。命名为“Kras；p53/p53；Cre”的纯合子小鼠在5-7周内发展为胰腺肿瘤。(图1B)将具有包括Ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白的合成腺病毒AdSyn-CO176静脉注射至Kras；p53/p53和Kras；p53/p53；Cre小鼠中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用IVISTM成像系统扫描5分钟。Kras；p53/p53小鼠具有正常的胰腺，且荧光素酶信号主要来自于脾。Kras；p53/p53；Cre小鼠具有胰腺肿瘤，且信号主要来自胰腺肿瘤。图2A-2B.在Cre-介导的基因操纵杂合模型中AdSyn-CO176在尾静脉注射之后感染胰腺肿瘤。(图2A)Kras；p53/p53小鼠如图1A所示。命名为“p53/+；Cre”的小鼠具有一个野生型p53等位基因和侧翼为LoxP位点的p53等位基因(LoxP-p53-LoxP)。这两个株系之间的繁殖产生这样的后代，其中Pdx1启动子驱动的Cre重组酶在胰腺细胞中介导肿瘤抑制基因p53的单个等位基因的缺失和突变体KrasG12D的激活。命名为“Kras；p53/+；Cre,”的这些杂合小鼠由于具有p53的一个野生型等位基因而在之后发展为肿瘤(4-9月龄时)。为使胰腺肿瘤发生，该野生型等位基因必须丧失或被突变。(图2B)将AdSyn-CO176静脉注射至p53/+；Cre和Kras；p53/+；Cre小鼠(4个月大)中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，然后使用IVISTM成像系统扫描5分钟。p53/+；Cre小鼠具有正常的胰腺，且信号主要来自于脾。4月龄的Kras；p53/+；Cre小鼠具有胰腺肿瘤，且信号主要来自肿瘤和肝脏。图3A-3C.AdSyn-CO176在尾静脉注射之后可以感染和诊断早期胰腺肿瘤。杂合Kras；p53/+；Cre小鼠在4-9个月内发展为胰腺肿瘤。为了检验AdSyn-CO176是否可以感染肿瘤发展极早期(肿瘤可见之前)的胰腺肿瘤，将AdSyn-176注射至2月龄的Kras；p53/+；Cre小鼠中，测量荧光素酶的表达。(图3A)将AdSyn-CO176静脉注射至2月龄的Kras；p53/+；Cre小鼠中。注射病毒之后72小时，收集组织，与荧光素一起孵育5分钟，并使用IVISTM成像系统扫描5分钟。2月龄的Kras；p53/+；Cre小鼠的胰腺看起来是正常的，但是在该组织中发现了荧光素酶信号。(图3B)显示正常胰腺(a)和胰腺肿瘤(b)的典型组织学H&E染色。(图3C)来自2月龄的Kras；p53/+；Cre小鼠的胰腺的H&E染色，其表明小部分胰腺正在发展为肿瘤(如多边形中所示)。大多数胰腺看起来是正常的。该结果表明，AdSyn-CO176可以感染极早期胰腺肿瘤。图4A-4B.AdSyn-CO176在胰腺肿瘤中感染基质细胞。在胰腺肿瘤中，仅有10％的细胞是癌细胞；其余90％是基质细胞。如通过免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)染色确定，被AdSyn-CO176感染的细胞是基质细胞。(图4A)用AdSyn-CO176感染的胰腺肿瘤的IHC染色。CK19是肿瘤细胞标记物，而平滑肌肌动蛋白(SMA)是基质细胞标记物。自AdSyn-CO176表达的GFP的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在受试者肿瘤细胞中表达转基因的方法，其包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：所述转基因；使所述合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳；和腺病毒34型(Ad34)纤维蛋白或者包括腺病毒5型(Ad5)轴结构域和Ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.12 US 62/433,1401.在受试者肿瘤细胞中表达转基因的方法，其包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：所述转基因；使所述合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳；和腺病毒34型(Ad34)纤维蛋白或者包括腺病毒5型(Ad5)轴结构域和Ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因是诊断性转基因。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述诊断性转基因编码荧光蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或橙色荧光蛋白。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述诊断性转基因编码酶。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是荧光素酶。7.根据权利要求2所述的方法，其中所述诊断性转基因包括正电子发射断层成像术(PET)报道基因。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因是治疗性转基因。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述治疗性转基因编码抗癌药剂。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述治疗性转基因编码破坏或杀死肿瘤基质细胞的药剂。11.诊断受试者患有肿瘤的方法，其包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：诊断性转基因；使所述合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳；和腺病毒34型(Ad34)纤维蛋白或者包括腺病毒5型(Ad5)轴结构域和Ad34隆突结构域的嵌合纤维蛋白。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述诊断性转基因包括正电子发射断层成像术(PET)报道基因。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述诊断性转基因编码荧光蛋白。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或橙色荧光蛋白。15.根据权利要求11所述的方法，其中所述诊断性转基因编码酶。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述酶是荧光素酶。17.治疗受试者中肿瘤的方法，其包括给所述受试者施用合成腺病毒，所述合成腺病毒包括：治疗性转基因；使所述合成腺病毒自肝脏去靶向的天然或修饰的衣壳；和腺病毒34型(Ad34)纤维蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·欧谢伊，C·鲍尔斯，张磊，
申请(专利权)人：萨克生物研究学院，
类型：发明
国别省市：美国,US