本发明专利技术提供了一种包含结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白(AAD)的药物组合物以治疗癌症或其他精氨酸依赖性疾病。该AAD融合蛋白可从粗蛋白的可溶性和不溶性级分中纯化出，其结合人血浆白蛋白(HSA)上，并具有用于有效消耗癌细胞中精氨酸的高活性和更长的半衰期。野生型ADI和本发明专利技术AAD的比活分别为8.4和9.2U/mg(在生理pH 7.4下)。本发明专利技术所使用的AAD可被用于治疗各种癌症(例如胰腺癌、白血病、头颈癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌、前列腺癌、胃癌和脑癌)以及用于治愈精氨酸依赖性疾病。该组合物可以单独使用或与至少一种化疗试剂联合使用以对癌症治疗和/或抑制转移产生协同作用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于癌症靶向治疗的含有结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶的 药物组合物 相关申请的交叉引用 本申请要求2013年3月6日提交的美国临时专利申请系列号61/773, 214和2014 年3月5日提交的美国非临时专利申请系列号14/197,236的权利，其公开内容以引用方式 全文并入于此。
本专利技术描述了结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶（AAD)融合蛋白，其已经通过基因修 饰形成具有高活性和长体内半衰期的物质。本专利技术进一步描述了用于制造不同ADD融合蛋 白的DNA和蛋白质工程化设计。该AAD融合蛋白能够从粗蛋白的可溶性级分和不溶性级分 (包涵体）中分离和纯化。本专利技术进一步涉及用于人和其他动物中的癌症靶向治疗和治愈 精氨酸依赖性疾病的含结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶的药物组合物。 专利技术背景 胰脏癌、结肠癌、肝癌、黑素瘤和宫颈癌在全球人口中的发病率正在增加，迫切需 要针对这些疾病的有效治疗方法。在许多类癌中，包括白血病、黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、 肾细胞癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌和肝癌，癌细胞因缺乏精氨琥珀酸合成酶 (ASS)的表达而成为精氨酸营养缺陷型，这使得这些癌症成为精氨酸消耗疗法极好的靶标。 精氨酸是人类以及其他哺乳动物的半必需氨基酸。它能够通过由尿素循环酶一一 精氨琥珀酸合成酶（ASS)和精氨琥珀酸裂解酶（ASL) -一催化的两步反应由瓜氨酸合 成。精氨酸能够被精氨酸酶代谢为鸟氨酸，鸟氨酸能够被线粒体中的鸟氨酸氨甲酰转移酶 (OTC)转换为瓜氨酸。瓜氨酸可被再次利用合成精氨酸。由于精氨琥珀酸合成酶（ASS)和 精氨琥珀酸裂解酶（ASL)丰富的催化活性，正常细胞通常不需要提供外源的精氨酸用于生 长。相反，许多类癌不能表达ASS因此成为精氨酸营养缺陷型。他们的生长依赖于仅从血 液循环中获得的精氨酸。因此，通过使用精氨酸降解酶靶向循环精氨酸是阻止ASS-阴性肿 瘤增长的一种可行策略。 精氨酸能够被精氨酸酶、精氨酸脱羧酶和精氨酸脱亚胺酶（ADI)降解。其中，精氨 酸脱亚胺酶（ADI)似乎对精氨酸有着最高的亲和力（低KJ直）。ADI将精氨酸转化为瓜氨 酸和尿素循环的代谢产物氨。不幸的是，ADI只存在于原核生物例如支原体（Mycoplasma sp.)中。从原核生物中分离和纯化ADI存在一些问题。从恶臭假单胞菌（Pseudomonas pudita)中分离的ADI不能在体内显示出有效，因为其在中性pH下酶活性低。从大肠杆菌 (Escherichia coli)中生产的ADI是无酶活性的，随后需要多次变性和复性过程从而增加 了随后的生产成本。 由于天然ADI是在微生物中发现的，因此它具有抗原性并且会从患者的循环中被 迅速清除。ADI的天然形式在注射进入人体循环后具有免疫原性，且半衰期短（大约4小 时）并能引起中和抗体。这些缺陷可以通过聚乙二醇化修饰来纠正。在各种形 式的聚乙二醇修饰ADI中，发现经由琥珀酰亚胺琥珀酸酯与聚乙二醇（分子量20, 000)结 合的ADI (ADI-PEG 20)是一种有效形式。然而，聚乙二醇化后ADI的活性显著降低了大约 50% 。以往制备经聚乙二醇修饰的 ADI 的尝试产生了非均一性的物质（这是由于PEG在蛋白质表面赖氨酸残基上的随机结合），在 生产过程中也很难对所述非均一性的物质表征和开展质量控制。此外，PEG非常昂贵，这极 大地增加了生产成本。将经过聚乙二醇修饰的ADI静脉注射到体内后，观察到游离PEG的 泄漏或分离，（没有PEG的）ADI则会引发免疫原性问题。因此，存在对改进的治疗癌症的 组合物的需求，特别是具有增强的活性和延长的体内半衰期的改进的癌症治疗组合物。
技术实现思路
在本专利技术中，结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶（AAD)融合蛋白增加了其活性以及血 浆半衰期从而有效地消耗癌细胞中的精氨酸。天然ADI可在微生物中发现，具有抗原性并 且在患者的体内循环中被迅速清除。本专利技术构建了具有一个或两个白蛋白结合蛋白的不 同AAD融合蛋白，以保持高活性同时具有更长的体内半衰期（一次注射能消耗精氨酸至少 5天）。在本专利技术中，AAD融合蛋白产品中结合白蛋白的蛋白似乎并不影响融合蛋白的酶比 活，却似乎增加了循环半衰期。野生型ADI和本专利技术中AAD融合蛋白的比活分别是8. 4和 9. 2U/mg(在生理 pH 7. 4 下）。 从最广泛意义上，本专利技术提供了一种结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其 包含含有选自白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白的一个或者两个组分的 第一部分，该第一部分融合到含有精氨酸脱亚胺酶的第二部分，以形成结合白蛋白的精氨 酸脱亚胺酶融合蛋白，从而使得该结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白保持精氨酸脱亚 胺酶的活性，并且还能够结合血清白蛋白。 本专利技术进一步涉及用于人和其他动物中的靶向癌症治疗的包含结合白蛋白的精 氨酸脱亚胺酶（AAD)融合蛋白的药物组合物。本专利技术的第一个方面是构建对癌细胞具有高 活性的修饰的AAD融合蛋白。本专利技术的第二个方面是从粗蛋白的可溶性级分和不溶性级分 中以高纯度纯化AAD融合蛋白。本专利技术的第三个方面是延长AAD融合蛋白的半衰期，因为 其能够在循环中很好地结合白蛋白。本专利技术的第四个方面是提供一种使用本专利技术的包含 AAD的药物组合物治疗癌症的方法，其通过将所述的组合物施用给患有各种肿瘤、癌症或与 肿瘤或癌症相关的疾病、或其他精氨酸依赖性疾病的有需要的对象。 本专利技术的AAD融合蛋白还经修饰以避免解离为白蛋白结合蛋白和ADI，从而使得 其变得更加稳定和在循环中具有更长的半衰期。在AAD融合产品中，ADI被融合到白蛋白 结合结构域/肽/蛋白上以延长融合产品的血浆半衰期和降低融合产品的免疫原性。白蛋 白结合结构域（ABD)是一种在血液中结合白蛋白的肽。存在不同的ABD变体，其显示出不 同的或提高的人血清白蛋白（HSA)亲和力。可构建不同的ABD变体并可融合到ADI。不同 于天然产生的ADI，这种更长半衰期的特性有效帮助在癌细胞、癌干细胞和/或癌祖细胞中 消耗精氨酸。 含有AAD融合蛋白的药物组合物能够用于静脉（i. V.)注射（对于速效的药物剂 量）和肌肉（i.m.)注射（对于相当速效和持久的药物剂量）。本专利技术中AAD融合蛋白的施 用可被用于治疗各种癌症，例如胰腺癌、白血病、头颈癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺 癌、宫颈癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌和脑癌。本专利技术涉及AAD融合蛋白，治疗癌症的方法，治疗 和/或阻止癌组织转移的方法，以及治愈精氨酸依赖性疾病的方法。 本专利技术的方法还包括使用不同的化疗药和/或放疗与本专利技术AAD融合蛋白的组合 以对癌症治疗产生协同效应。 附图简要说明 图1以三维结构显示的构建具有一个或两个白蛋白结合结构域/肽/蛋白的不同 AAD融合蛋白的设计方式。可将一个或两个白蛋白结合结构域/肽/蛋白融合到ADI以形 成AAD融合蛋白。白蛋白结合结构域/肽/蛋白的位置远离ADI活性位点。可将白蛋白结 合结构域/肽/蛋白融合到ADI的N端或/和C端。本图中的结构是基于精氨酸支原体的 ADI结构（蛋白数据库：1LXY)。（A)天然ADI ;⑶具有两个ABD或ABDl的AAD融合蛋白； (C)在N端具有一个ABD或ABDl的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，包含含有选自白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白的一个或者两个组分的第一部分，该第一部分融合到含有精氨酸脱亚胺酶的第二部分，以形成结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，从而使得结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白保持精氨酸脱亚胺酶活性并且还能够结合血清白蛋白。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳镠，卫凤文，郭瑞仪，梁润松，
申请(专利权)人：视界全球控股有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港;81
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